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聚合酶鏈反應(yīng)檢測單純皰疹病毒糖蛋白G基因片段

發(fā)布時間： 2016-07-11 18:10:37      來源：健康族
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聚合酶鏈反應(yīng)檢測單純皰疹病毒糖蛋白G基因片段中華皮膚科雜志1999年第6期第32卷短篇論著作者：方險峰白樺宋彪涂裕英單位：510630廣州，中山醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院皮膚科單純皰疹

聚合酶鏈反應(yīng)檢測單純皰疹病毒糖蛋白G基因片段

中華皮膚科雜志1999年第6期第32卷短篇論著

作者：方險峰白樺宋彪涂裕英

單位：510630廣州，中山醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院皮膚科

單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白G(gG)基因位于HSVUS4序列區(qū)，是型間差異最大的一個糖蛋白基因，目前對其功能尚不甚明了，以此作為“靶位點”分型檢測臨床樣本單純皰疹病毒感染的PCR方法報道亦較少。我們建立并初步評價了一種可同時分型檢測HSVgG基因的PCR方法，現(xiàn)報道如下。

一、材料與方法

1.臨床標本：選擇我科門診臨床診斷為生殖器皰疹(GH)的病例40例，共收集GH早期皮疹(水皰、膿皰)標本17份，中晚期皮疹(潰瘍、結(jié)痂創(chuàng)面)標本23份，泌尿生殖道拭子標本40份。

2.HSV培養(yǎng)及鑒定：以Vero細胞分離培養(yǎng)HSV[1]。陽性培養(yǎng)結(jié)果以單克隆抗體間接免疫熒光試驗予以鑒定(LP10抗HSV-ⅠgG，AP1抗HSV-ⅡgG，均由英國劍橋大學Minson教授惠贈)。HSV國際參考株HSV-ⅠF株，HSV-Ⅱ333株由湖北醫(yī)科大學病毒研究所提供，并以微量空斑計數(shù)法標定病毒滴度。

3.HSVgG基因PCR方法：PCR引物設(shè)計參照已經(jīng)公布的HSVDNA序列[1]，通過PCGENE軟件比較HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA的同源性，選擇HSV-ⅠUS4序列區(qū)4351bp～4370bp片段為HSV-Ⅰ上游引物；HSV-ⅡHindⅢL序列區(qū)4707bp～4726bp片段為HSV-Ⅱ上游引物；HSV-ⅠUS4序列4818bp～4837bp(或HSV-ⅡHindⅢL序列區(qū)4903bp～4922bp)片段為型共同下游引物。按文獻處理臨床標本，構(gòu)建PCR擴增反應(yīng)體系并進行擴增反應(yīng)[2]。溫度循環(huán)按94℃45s、58℃45s、72℃1min進行。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果，出現(xiàn)216bp條帶為HSV-Ⅱ陽性，出現(xiàn)490bp條帶為HSV-Ⅰ陽性，對臨床標本進行檢測時以0.75空斑形成單位(pfu)HSV-ⅠF株及1.25pfuHSV-Ⅱ333株培養(yǎng)液為陽性對照(參見結(jié)果部分)。

對HSVgG基因PCR法與細胞培養(yǎng)法結(jié)果不一致的標本，以常用的HSVDNA聚合酶基因PCR法再次檢測[3]。本文數(shù)據(jù)分析以SAS軟件包進行χ2檢驗或精確概率法檢驗。

二、結(jié)果

1.引物設(shè)計：PCR引物選自gG基因跨膜區(qū)編碼區(qū)，3條引物G＋C含量均在61％左右，以PCROligo軟件檢索引物內(nèi)部無重復序列，無發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成，引物間無4個以上連續(xù)堿基配對，且與已知DNA序列無配合。擴增產(chǎn)物在490bp及216bp處出現(xiàn)明亮帶型，未見其它分子量帶型出現(xiàn)。以標準病毒液為模板，當HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ量分別低于0.75pfu及1.25pfu時，即無明顯擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。

2.臨床標本細胞培養(yǎng)法與HSVgG基因PCR法檢測結(jié)果：80份臨床標本細胞培養(yǎng)法與gG基因PCR法陽性者分別為32份(40％)及42份(52.5％)，兩者差異具有顯著性(P=0.005)；生殖器皰疹不同類型標本的陽性檢出率見表1，中晚期皮疹標本HSVgG基因PCR法的陽性檢出率顯著高于細胞培養(yǎng)法(P=0.033)。30份細胞培養(yǎng)法與gG基因PCR法均陽性的標本，29份兩法分型結(jié)果一致(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ、HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染分別為2例、26例及1例)，1份細胞培養(yǎng)法示HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染，但gG基因PCR法示HSV-Ⅱ單獨感染，經(jīng)HSVDNA聚合酶基因PCR法再檢測仍為HSV-Ⅱ單獨感染。

細胞培養(yǎng)法與HSVgG基因PCR法出現(xiàn)14份不一致檢測結(jié)果，12份gG基因PCR法陽性但細胞培養(yǎng)法陰性，經(jīng)HSVDNA聚合酶基因PCR法再檢測全部陽性。2份gG基因PCR法假陰性，經(jīng)HSVDNA聚合酶基因PCR法再檢測1份陽性，1份陰性。

表1生殖器皰疹不同類型標本細胞培養(yǎng)法與gG基因PCR法的陽性檢出率比較

標本類型標本數(shù)細胞培養(yǎng)陽性數(shù)(％)PCR法*陽性數(shù)(％)P值早期皮疹拭子1716(94.1)14(82.4)0.301中晚期皮疹拭子235(21.7)12(52.2)0.033泌尿生殖道拭子4011(27.5)16(40.0)0.172注：為gG基因PCR法

若以細胞培養(yǎng)法及HSVDNA聚合酶基因PCR法為“擴大金標準”，則HSVgG基因PCR法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為95.5％、100％、100％及94.7％。

三、討論

近年來流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)生殖器HSV-Ⅰ感染呈上升趨勢[4]，對生殖器皰疹的臨床診斷只進行HSV-Ⅱ檢測，勢必造成部分病例漏診。為此我們選擇了HSVgG基因跨膜區(qū)編碼區(qū)，設(shè)計了兩條型特異性上游引物及一條型共同下游引物，一次可同時分型擴增檢測HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA。擴增片段的長度相差一倍以上，結(jié)果易于判斷。對生殖器皰疹標本檢測的結(jié)果表明，gG基因PCR法不論在總體陽性率還是對生殖器皰疹中晚期皮疹標本的陽性檢出率均顯著高于細胞培養(yǎng)法(P值分別為0.005及0.033)；與單克隆抗體間接免疫熒光試驗的比較證實其分型結(jié)果可靠，并可同時分型檢測HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ，從而避免了HSV-Ⅰ的漏檢，具有一定的臨床應(yīng)用價值。本文發(fā)現(xiàn)2份標本gG基因PCR法假陰性，對其細胞培養(yǎng)液再檢測均陽性，排除了引物設(shè)計的影響；經(jīng)HSVDNA聚合酶基因PCR法再檢測1例陽性，1例陰性；證實gG基因PCR法假陰性的原因可能為標本HSV滴度過低，超過了gG基因PCR法的最低檢測極限，尚有待改進。

參考文獻

1白樺，佟菊貞，葉興東，等.生殖器皰疹的診斷及特征探討.中華皮膚科雜志，1996，29：169－171.

2伍新堯，羅超泉，楊英浩.基因診斷原理與臨床.第1版.廣州：中山大學出版社，1995.

3PiiparinenH,VaheriV.Genotypingofherpessimplexvirusesbypolymerasechainreaction.ArchVirol,1991,119:275.

4NageswaranA,ShenRN,KinghornGR,etal.Apparentincreaseintheprevalenceofherpessimplexvirustype1genitalinfectionsamongwomen.GenitourinMed,1994,70:427.

(收稿：1998－11－18修回：1999－02－25)

（責任編輯：zxwq）

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