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瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成的實(shí)驗(yàn)研究

中華皮膚科雜志1999年第6期第32卷論著

作者：何威劉榮卿鐘白玉

單位：劉榮卿鐘白玉400038重慶,第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科；何威現(xiàn)在第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科400037

關(guān)鍵詞：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原

【摘要】目的探討瘢痕疙瘩中膠原過(guò)度聚集的原因。方法從正常皮膚與活躍增生瘢痕疙瘩標(biāo)本分別培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞，采用3H－脯氨酸摻入法分別檢測(cè)單層培養(yǎng)及膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞的膠原合成量。用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)單層培養(yǎng)細(xì)胞的人前α1(Ⅰ)型膠原mRNA水平。結(jié)果瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA水平升高，其膠原合成量也顯著高于正常真皮成纖維細(xì)胞（P＜0.01）。結(jié)論在增生活躍瘢痕疙瘩中，成纖維細(xì)胞膠原合成功能處于活化狀態(tài)，膠原合成增加是導(dǎo)致膠原過(guò)度積聚的重要原因。

ExperimentalStudyonCollagenSynthesis

inCulturedKeloidFibroblasts

HEWei,LIURongqing,ZHONGBaiyu.

DepartmentofDermatology，SouthwestHospital，

ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethecauseofexcessivecollagenaccumulationinkeloidtissue.MethodsHumandermalfibroblastswereculturedfromkeloidandnormalskin.Collagenproductionbyfibroblastsinmonolayercultureandincollagengelwasassessedby3Hprolineincorporation.TypeⅠprocollagenmRNAleveloffibroblastsinmonolayerculturewasdeterminedbydotblothybridizationusinghumanproα1(Ⅰ)collagenspecificcDNAprobe.ResultsThecollagensynthesissignificantlyincreasedinkeloidfibroblastlines(P＜0.01),acompaniedbyariseintypeⅠprocollagenspecificmRNAlevelsincomparisonwithnormaldermalfibroblastlines.ConclusionThesefindingssuggestthatthefibroblastsareactivatedincollagensynthesisinactivekeloid.Theenhancedcollagensynthesisbyfibroblastsmightcontributetoexcessivecollagnaccumulationinkeloid.

【Keywords】KeloidFibroblastsCollagen

瘢痕疙瘩是與異常創(chuàng)傷反應(yīng)有關(guān)的一種特殊類型的瘢痕，與硬皮病以及具有硬皮病樣皮膚改變的一些疾病一起歸入真皮纖維化疾病的范疇，還被視為起源于真皮網(wǎng)狀層的良性纖維組織腫瘤。因此，它是研究創(chuàng)傷異常愈合、纖維增生和真皮纖維化的一個(gè)模型。迄今為止，瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚。為了探討瘢痕疙瘩中膠原過(guò)度聚集的原因，我們對(duì)漢族人增生活躍的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成情況進(jìn)行了研究。

材料和方法

一、標(biāo)本選擇標(biāo)準(zhǔn)及來(lái)源

為避免年齡差異以及某些疾病和藥物對(duì)膠原代謝的影響，對(duì)瘢痕疙瘩患者、無(wú)瘢痕疙瘩及其形成傾向個(gè)體（以下簡(jiǎn)稱非瘢痕疙瘩個(gè)體）均限定為16～40歲，無(wú)結(jié)締組織疾病或可能影響結(jié)締組織代謝的疾病，未系統(tǒng)應(yīng)用皮質(zhì)類固醇及其它可能影響結(jié)締組織代謝藥物的漢族人個(gè)體。根據(jù)典型臨床特點(diǎn)確定瘢痕疙瘩的診斷[1，2]，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)。選擇近1年內(nèi)未接受局部外用藥物、注射藥物和放射治療并處于增生活躍階段的瘢痕疙瘩用于研究。為避免瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)，手術(shù)后局部行放療并配合醋酸確炎舒松A針劑封閉。瘢痕疙瘩及其鄰近正常皮膚由本科瘢痕疙瘩專病門診在局麻下手術(shù)切取，非瘢痕疙瘩個(gè)體的胸部正常皮膚標(biāo)本由胸心外科和腎外科提供。手術(shù)獲得的新鮮皮膚標(biāo)本立即置于DMEM培養(yǎng)液中，4℃保存待用。

二、方法

(一)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)以組織塊法實(shí)施[3]，分別從瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚和非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚標(biāo)本中培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞，用內(nèi)含10％胎牛血清的DMEM（Sigma公司）培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2孵箱（美國(guó)SHEL-LAB1815TC型）中培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)液2次。待原代培養(yǎng)長(zhǎng)出的成纖維細(xì)胞接近或達(dá)到融合，用0.25％胰蛋白酶液消化并傳代，傳代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞均稱為細(xì)胞系（cellline）。

(二)人Ⅰ型前膠原特定cDNA探針的制備與標(biāo)記：以堿裂解法從大腸桿菌61322(Americantissueculturecollection,ATCC)中大規(guī)模提取含人前α1(Ⅰ)型膠原cDNA克隆Hf-677的質(zhì)粒DNA，聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA，EcoRI酶切后行DNA瓊脂糖凝膠電泳，得1.5kb的目的片段，用電洗脫法從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段[4]。用地高辛標(biāo)記(BoehringerMannheim公司)前α1(Ⅰ)型膠原cDNA探針。

(三)單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞膠原合成的檢測(cè)：分別測(cè)定從瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚和非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚標(biāo)本中培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞的膠原合成量，第2～4代的細(xì)胞系用于研究。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（10000個(gè)/孔），每孔中加培養(yǎng)液200μL，每一細(xì)胞系設(shè)3個(gè)復(fù)孔。為避免培養(yǎng)液中血清所含細(xì)胞因子對(duì)膠原合成的可能影響，檢測(cè)膠原合成時(shí)統(tǒng)一使用含抗壞血酸(50μg/mL)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。采用24h標(biāo)記期3H－脯氨酸(中國(guó)原子能研究院同位素研究所)摻入（摻入量0.5μCi/孔）穩(wěn)態(tài)、融合的單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中，用胃蛋白酶消化法檢測(cè)培養(yǎng)液中膠原量[5]。該方法是利用胃蛋白酶在低溫下將非膠原蛋白降解，而膠原僅被切去非螺旋的末端，再用過(guò)氯酸沉淀膠原的三螺旋部分。將沉淀物收集于玻璃纖維濾膜上，然后按常規(guī)準(zhǔn)備液體閃爍計(jì)數(shù)標(biāo)本，用液閃測(cè)量?jī)x（瑞典LKB-1217型）進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)，測(cè)定其放射活性，以此作為培養(yǎng)液中的膠原量。另以胰蛋白酶液消化處理已吸去培養(yǎng)液的細(xì)胞，終止消化反應(yīng)后，將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾膜上，同上準(zhǔn)備液體閃爍計(jì)數(shù)標(biāo)本并進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)，以此作為細(xì)胞內(nèi)的膠原量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以dpm/1000細(xì)胞表示。

(四)膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞膠原合成的檢測(cè)：無(wú)菌條件下用大白鼠尾腱制備酸溶鼠尾膠原溶液（1mg/mL）。按1份10倍DMEM濃縮液、8份膠原溶液和1份成纖維細(xì)胞的DMEM懸液的比例制備成纖維細(xì)胞膠原凝膠[6]。24孔培養(yǎng)板中每孔膠原凝膠1mL，內(nèi)含105個(gè)細(xì)胞，每孔加入1.5mL培養(yǎng)液。檢測(cè)成纖維細(xì)胞膠原合成時(shí)，每孔摻入2μCi3H－脯氨酸12h。所用培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件同上。收集并漂洗膠原凝膠,用0.1％膠原酶液在37℃消化2h后，將樣品收集于玻璃纖維濾膜上，同上準(zhǔn)備液體閃爍計(jì)數(shù)標(biāo)本并進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以dpm/1000細(xì)胞表示。

(五)RNA斑點(diǎn)雜交檢測(cè)單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)：用異硫氰酸胍一步法分別從單層培養(yǎng)的瘢痕疙瘩與非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚的成纖維細(xì)胞中提取RNA，以含人前α(Ⅰ)型膠原cDNA的質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照，以pBR322質(zhì)粒作陰性對(duì)照。將抽提的RNA和對(duì)照樣品點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，用地高辛標(biāo)記的人前α(Ⅰ)型膠原cDNA探針與之進(jìn)行斑點(diǎn)雜交[7]，顯色適度后終止反應(yīng)。用薄層掃描儀（美國(guó)CS－9000型）對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行掃描分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用第三軍醫(yī)大學(xué)數(shù)學(xué)教研室SPMR統(tǒng)計(jì)程序包PDA-2程序進(jìn)行單因素方差分析及均數(shù)比較。

結(jié)果

瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚和非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚的成纖維細(xì)胞在單層培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)差異無(wú)顯著性，它們?cè)谌S培養(yǎng)體系中的形態(tài)及收縮凝膠情況也無(wú)明顯差異。在三維培養(yǎng)體系中，由于膠原凝膠不同層次均有細(xì)胞生長(zhǎng)，在倒置顯微鏡下可見不同焦距的細(xì)胞不甚清晰（圖1）。

圖1膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞

單層培養(yǎng)狀態(tài)下，瘢痕疙瘩及其相鄰正常皮膚的成纖維細(xì)胞的膠原合成量的比較見表1，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成量的比較見表2。從表1和表2看出，不論是細(xì)胞內(nèi)還是培養(yǎng)液中，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成量不但顯著高于其相鄰正常皮膚成纖維細(xì)胞，而且還顯著高于非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚成纖維細(xì)胞。

表1瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與其相鄰正常皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成量

(±s,dpm/1000細(xì)胞)

成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)瘢痕疙瘩(4例)175.88±49.97294.38±70.20瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚(4例)109.13±10.10130.65±43.61t值2.623.96P值＜0.01＜0.01注：3例標(biāo)本取自胸部，1例標(biāo)本取自三角肌區(qū)

表2瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮

膚成纖維細(xì)胞的膠原合成量(±s,dpm/1000細(xì)胞)

成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)瘢痕疙瘩(6例)171.07±41.35275.45±79.29非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚(5例)113.54±17.64134.12±14.99t值2.883.89P值＜0.010.01注：瘢痕疙瘩與正常皮膚均取自胸部

在膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中，瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚和非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚的成纖維細(xì)胞的膠原合成量分別為(41.43±13.17)、(16.43±6.21)、(14.13±5.44)dpm/1000細(xì)胞，其中瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成量不但顯著高于瘢痕疙瘩相鄰正常皮膚成纖維細(xì)胞（t=2.90,P＜0.01），還顯著高于非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚的成纖維細(xì)胞（t=3.20,P＜0.01）。

用Ⅰ型前膠原cDNA探針與培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中提取RNA的斑點(diǎn)雜交結(jié)果見圖2，為確定Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)量，用薄層掃描儀對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行掃描，計(jì)算其吸收峰值，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞為7133.03±268.76，正常皮膚成纖維細(xì)胞為4175.60±233.18，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA量明顯高于從非瘢痕疙瘩個(gè)體正常皮膚中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。

Al-2、Bl-2、Cl-2為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，A3-4、B3-4

為正常皮膚成纖維細(xì)胞C3為陽(yáng)性對(duì)照

2用I型膠原cDNA探針與培養(yǎng)成纖維細(xì)胞RNA的斑點(diǎn)雜交結(jié)果

討論

既往對(duì)黑人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，只有部分細(xì)胞系顯示了膠原合成增加和膠原基因表達(dá)增強(qiáng)；但對(duì)白人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的研究卻發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩與正常皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成量以及膠原基因表達(dá)無(wú)顯著差異[1，2]。似乎瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成功能與個(gè)體因素和種族因素還有一定關(guān)系。我們還注意到，這些研究在對(duì)照皮膚解剖部位的對(duì)應(yīng)性，特別是瘢痕疙瘩臨床活動(dòng)性的差異等方面均未很好控制，而上述因素對(duì)瘢痕疙瘩的研究特別是成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果均可能產(chǎn)生影響。本研究以漢族人中增生活躍的瘢痕疙瘩患者為研究對(duì)象，在充分注意標(biāo)本選擇和控制實(shí)驗(yàn)條件的前提下，除了單層培養(yǎng)外，還首次對(duì)膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成進(jìn)行了研究，此種三維培養(yǎng)體系能較好地模擬成纖維細(xì)胞在活體組織中的生長(zhǎng)環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA水平升高，其在單層培養(yǎng)時(shí)的膠原合成量不但較正常皮膚成纖維細(xì)胞顯著增加，并且在膠原凝膠三維培養(yǎng)體系中的膠原合成量仍顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。這些結(jié)果表明，在增生活躍的瘢痕疙瘩中，成纖維細(xì)胞膠原合成功能處于高度活化狀態(tài)，膠原合成增加是瘢痕疙瘩中膠原過(guò)度積聚的重要原因。為什么在瘢痕疙瘩中已存在膠原過(guò)度積聚的情況下，其成纖維細(xì)胞的膠原合成功能未受到細(xì)胞外膠原的反饋抑制呢？我們推測(cè)這可能與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表面的膠原受體——整合素受體的表達(dá)減少有關(guān)，從而使得細(xì)胞外膠原對(duì)成纖維細(xì)胞膠原合成功能的反饋抑制作用難以發(fā)揮。

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(收稿：1998－12－14修回：1999－04－28)

（責(zé)任編輯：zxwq）