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人乳頭瘤病毒18型E6E7反義RNA表達重組體的構建

發(fā)布時間： 2016-07-11 18:13:08      來源：健康族
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人乳頭瘤病毒18型E6E7反義RNA表達重組體的構建中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著作者：郭慶曾凡欽呂凌王斌單位：510120廣州，中山醫(yī)科大學孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科(郭慶

人乳頭瘤病毒18型E6E7反義RNA表達重組體的構建

中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著

作者：郭慶曾凡欽呂凌王斌

單位：510120廣州，中山醫(yī)科大學孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科(郭慶曾凡欽)；分子醫(yī)學研究中心［呂凌(指導者)王斌(指導者)］

關鍵詞：HPV18E6E7；逆轉錄病毒載體；反義RNA

【摘要】目的為了探討人乳頭瘤病毒(HPV)的致病機理和尋找由HPV所致疾病的治療途徑，研究了HPV18型E6E7反義RNA表達重組體的構建。方法以HPV18型全基因質粒為模板，聚合酶鏈反應擴增出HPV18型E6E7區(qū)816bp片段，以逆轉錄病毒pLNSX為載體，構建HPV18型E6E7逆轉錄病毒重組體，并以限制性內切酶酶切和Southern雜交分別鑒定插入方向和特異性檢測。結果和結論篩選出可表達HPV18型E6E7逆轉錄病毒重組體。該反義RNA表達重組體的構建為進一步研究E6E7基因的作用，以及探索是否能通過反義技術調控E6E7基因的表達打下基礎。

ConstructionofHumanPapillomavirusType18E6E7AntisenseRNAExpressingRecombinantsGuoQing,ZengFanqin,LuLing,etal.DepartmentofDermatology,MemorialHospitalofSunYat-SenUniversityofMedicalSciences,Guangzhou510120

【Abstract】ObjectiveInordertostudythepathogenesisofhumanpapillomavirus(HPV)andseekforatherapeuticapproachofthediseasescausedbyHPV,theconstructionofHPV18E6E7antisenseRNAexpressingrecombinantswasstudied.MethodsWeamplifiedtheHPV18E6E7816bpbyPCRwithHPV18plasmidDNAasthetemplate.pLNSXretroviruseswereusedasvectors,theHPV18E6E7retrovirusrecombinantswereconstructed.AndthentherecombinantswerecleavedwithrestrictionendonucleaseandhybridizedwithSouthernblotforidentifyingtheinsertingdirectionandspecialcheckrespectively.ResultsandconclusionTheHPV18E6E7antisenseRNA-retrovirusexpressingrecombinantswerescreenedandobtained,whichhadlaidthefoundationofstudyingthefunctionofE6E7genesfurtherandexplorewhethertheantisensetechniquecanadjustandcontroltheexpressionofE6E7genes.

【Keywords】HPV18E6E7RetrovirusvectorAntisenseRNA[HJ

人乳頭瘤病毒(HPV)是與性傳播疾病和生殖器腫瘤密切相關的小DNA病毒。由HPV引起的肛周、生殖器疣的發(fā)病率近年來急劇上升，且治療困難，復發(fā)率高；現(xiàn)已證明某些類型的HPV與生殖器腫瘤關系密切［1］。因此，如何控制HPV感染是當今研究的熱點之一。近幾年以反義技術研究和調控基因的表達［2，3］，已開辟了基因治療的新領域，并已取得一些進展［4］。本實驗利用聚合酶鏈反應(PCR)技術，擴增了HPV18型E6E7基因，并成功地構建了可表達HPV18型E6E7反義RNA逆轉錄病毒重組體，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

(一)菌種和試劑：HPV18全基因重組質粒和逆轉錄病毒載體pLNSX自行構建和備用，宿主菌JM109，PCR試劑盒，限制性內切酶，瓊脂酶，Klenow酶，T4DNA連接酶，DIG-DNA探針標記試劑盒均購自德國BeohringerMamheim公司(BM公司)。

(二)引物設計：以基因庫中的A06324號序列為藍本設計引物。A06324號序列為HPVE1、E6/E7基因序列。上游引物：5′-CCACAATACTATGGCGCGCTT

TG-3′，為A06324號序列中的108-130nt順序。下游引物：5′-TGCTTACTGCTGGGATGCACACC-3′，為A06324號序列901-923nt順序。以DNASIS7.1版本軟件設計后以ABI391型全自動寡核苷酸合成儀人工合成。

(三)目的基因擴增：以克隆的HVP18型DNA為模板，以上述引物進行PCR擴增，得HPVE6E7區(qū)816bp的片段。后者以Klenow酶補齊末端后以低熔點瓊脂糖電泳回收。

(四)基因克?。阂阅孓D錄病毒載體pLNSX(基因庫中SYNMMLPLN2號序列)為載體，經HindⅢ酶切后以Klenow酶補齊末端，然后與低熔點瓊脂糖回收的HPVE6E7區(qū)816bp片段共同沉淀。沉淀物加T4DNA連接酶連接，連接物轉化感受態(tài)E.ColiJM109后涂LBA板培養(yǎng)，以X-gal/IPTG篩選白色菌落進一步鑒定。

(五)克隆鑒定：將篩選出的陽性克隆，按常規(guī)方法進行限制性內切酶酶切和電泳。pLN-HPV酶切圖譜見圖1。

圖1pLN-HPV酶切圖譜

(六)雜交鑒定：將回收的816bp目的基因用DIG-DNA探針標記試劑盒進行隨機引物標記以制備探針。將圖2電泳模式以尼龍膜作Southern電泳轉移，然后與上述探針進行雜交。

圖2pLN-HPV酶切PCR鑒定圖

結果

(一)酶切鑒定插入方向：根據圖1目的基因反向插入載體的酶切圖譜，將篩選出的陽性克隆進行酶切和電泳，第9泳道為PCR擴增的HPVE6E7片段(目的基因)；第8泳道為HindⅢ酶切的逆轉錄病毒載體pLNSX；第7、6、5、4、3泳道為目的基因反向插入逆轉錄病毒載體后分別以CLaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ等酶切，第2泳道為上游和下游引物對重組體pLN-HPV質粒DNA進行長片段PCR擴增的產物，理論計算應產生附表的酶切片段。

實際電泳結果見圖2，以第1泳道為DNA分子量

附表克隆的HPV18經部分限制性酶切及PCR產物電泳結果

泳道內切酶/PCR酶切片段大小(bp)2長片段PCR擴增8203EcoRⅠ5356，16134SmaⅠ3094，2005，18705XbaⅠ6399，5706BamHⅠ5831，11387CLaⅠ69698HindⅢ61499PCR擴增820標準SppⅠ/EcoRⅠ，其DNA條帶大小(bp)如圖2所示，將圖2右側的其余泳道跑出條帶分別與分子量標準條帶比較，可知其所有片段大小與理論計算值是完全符合的。

(二)雜交鑒定：結果見圖3。第9泳道的目的基因雜交陽性；第8泳道的載體陰性；第7泳道的線性化重組體陽性；第6泳道的1138bp條帶陽性而5831bp條帶陰性；第5泳道的6399bp條帶陽性而570bp條帶陰性；第4泳道的1870bp條帶陽性而3094bp條帶陰性；第3泳道的5356bp條帶陽性而1613bp條帶陰性；第2泳道的PCR擴增產物雜交陽性。

圖3pLN-HPVSouthern雜交鑒定圖

討論

HPV至今不能體外培養(yǎng)。HPV16或18型E6E7為目前國內外學者研究最多的一對基因［5，6］。因為，①這2型E6E7能完整地整合入宮頸癌細胞內，并能穩(wěn)定傳代；②E6E7的mRNA在宮頸癌中呈高水平表達，其合成的蛋白能與細胞中的腫瘤抑制基因產物p53蛋白或p105Rb蛋白結合，參與細胞轉化和腫瘤發(fā)生［7，8］；③在HPV所致皮膚、粘膜良性病變中，E6E7與維持病毒DNA在染色體外高拷貝數有關［9］。為進一步證實E6E7的作用，以及探索是否能通過反義技術調控E6E7基因的表達，我們首先研究了HPV18型E6E7反義RNA表達重組體的構建。本研究使用PCR技術和基因克隆技術獲取了pLN-HPVE6E7重組體，其逆轉錄病毒載體pLNSX采用的是基因庫中的SYNMMLPLN2號序列，基因片段為6149bp，與以往我們使用的載體pzip-neoSV(X)比較［10］，其可供選擇的酶切位點增加，基因序列了解更清楚，致腫瘤性減少，因此，是新一代載體；限制性內切酶可精確地識別DNA鏈上酶切位點，酶切產生若干大小不同的核酸片段，電泳后進行測定，即可確定插入方向，本文圖2的實際酶切結果完全與理論計算值相符，證實所篩選的重組體就是反義RNA重組體。本研究中Southern核酸雜交以目的基因片段為探針，進一步證實了重組體中目的基因的存在，圖3可見凡含目的基因片段出現(xiàn)雜交陽性帶，與圖2比較，不含目的基因片段出現(xiàn)雜交陰性(缺失)。我們使用限制性內切酶鑒定結合Southern核酸雜交法，起到了互為補充、互相證實的作用。

參考文獻

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3WilsonJM,JeffersonDM,ChowphuryJR,etal.Retrovirus-mediatedtransductionofadulthepatocytes.ProcNatlAcadSciUSA,1988,85∶3014-3018.

4米慶勝,周麗綜述.反義技術與病毒性皮膚病.國外醫(yī)學皮膚性病學分冊,1996,22∶26-28.

5WatanabeS,KandaT,YoshiikeK.GrowthdependenceofHPV16DNA-positivecervicalcancercelllinesandHPV16-transformedhumanandratcellsontheviraloncoproteins.IntJCancer,1993,84∶1043-1049.

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7HuG,LiuW,HananiaEG,etal.SuppressionoftumorigenesisbytranscriptionunitsexpressingtheantisenseE6andE7mRNAforthetransformingproteinsofHPVandthesensemRNAfortheretinoblastomageneincervicalcarcinomacells.CancerGeneTher,1995,2∶19-32.

8MungerK,PhelpsWC,BubbV,etal.TheE6andE7genesoftheHPV16togetherarenecessaryandsufficientfortransformationofprimaryhumankerationcytes.JVirol,1989,10∶4419-4421.

9侯云德.分子病毒學.北京:學苑出版社,1990.187-196.

10王斌,曹麗萍,楊斌,等.構建人CD23及其反義RNA的逆轉錄病毒表達重組體.中山醫(yī)科大學學報,1996,17∶91-94.

（責任編輯：zxwq）

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