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抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的臨床意義

中華皮膚科雜志1999年第1期第32卷論著

作者：羅婷趙明輝馬圣清

單位：羅婷、馬圣清(100034北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科)；趙明輝(腎臟內(nèi)科)

關(guān)鍵詞：紅斑狼瘡；系統(tǒng)性；抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體

【摘要】目的為了探討抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的臨床意義。方法通過(guò)間接免疫熒光(IIF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡方法檢測(cè)了84份SLE患者血清ANCA的陽(yáng)性率和6種已知的靶抗原：蛋白酶3、髓過(guò)氧化物酶、殺菌－通透性增高蛋白、彈力蛋白酶、組蛋白酶G和乳鐵蛋白。結(jié)果間接免疫熒光法檢測(cè)ANCA在SLE中的陽(yáng)性率是22.6％，均為核周型ANCA；分別有44.1％和14.3％的SLE患者血清含有抗組蛋白酶G和乳鐵蛋白自身抗體，且活動(dòng)期的陽(yáng)性率明顯高于穩(wěn)定期。結(jié)論組蛋白酶G為ANCA的主要靶抗原，且抗組蛋白酶G抗體與SLE的病情活動(dòng)有關(guān)。

AntineutrophilCytoplasmicAntibodiesandTheirTargetAntigensinPatientswithSystemicLupusErythematosus

LUOTing,ZHAOMinghui,MAShengqing.departmentofDermatology,FirstTeachingHospital,BeijingMedicalUniversity,beijing100034

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheclinicalsignificanceofantineutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)andtheirtargetantigensinsystemiclupuserythematosus(SLE).Methods84serumsampleswerecollected,andindirectimmunofluorescence(IIF)andELISAwereusedtodetectthepositiveratesofANCAand6knowntargetantigen,the6specificANCAantigensincludedproteinase3(PR3),myeloperoxidase(MPO),bactericidal/permeability-increasingprotein(BPI),humanleukocyteelastase(HLE),cathepsinG(CG)andlactoferrin(LF).PositiveserawerefurthurstudiedbyWesternblotanalysis.ThepositiverateofANCAwasalsocomparedbetweenpatientswith(n=50)andwithout(n=34)lupusactivitiestorevealwhetherANCAwerecorrelatedwithlupusactivities.Results22.6％serashowedANCApositivebyIIFmethod,andallofthemwereperipheralnuclearaNCA.However,ELISAtestingshowedthat44.1％and14.3％serarecognizedCGandLF,respectively.Thepositiveratesofanti-CG,andanti-LFantibodiesinpatientswithactivelupusweresignificantlyhigherthanthoseinnon-activepatients(P＜0.001).ConclusionThetargetantigenofANCAinSLEpatientswasCG,andanti-CGantibodiesmightbecorrelatedwithlupusactivities.

【Keywords】Lupuserythematosus,systemicAntineutrophilcytoplasmicantibodies

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)是以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體。有研究報(bào)道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中ANCA有一定的陽(yáng)性率，但是文獻(xiàn)中對(duì)靶抗原的報(bào)道并不一致，對(duì)ANCA在SLE中的臨床意義也有爭(zhēng)議[1，2]。為此，我們檢測(cè)了84份SLE患者血清中6種已知的ANCA靶抗原和陽(yáng)性率，并且初步探討了ANCA在SLE中的臨床意義。

材料和方法

一、臨床資料

84份SLE患者血清采自1992年1月至1997年8月我科就診的患者。所有病例均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)Urowitz等提出的狼瘡活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)[3]分為活動(dòng)期和穩(wěn)定期，其中活動(dòng)期血清50份，穩(wěn)定期血清34份。58份正常人血清為對(duì)照。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.間接免疫熒光法(IIF)：從正常人靜脈抗凝血中分離白細(xì)胞為底物進(jìn)行IIF檢測(cè)[4]。制備底物的方法簡(jiǎn)述如下：健康人肝素抗凝血10mL，加預(yù)冷的4倍紅細(xì)胞溶解液(0.83％nH4Cl10mmol/LKHCO30.1mmol/LEDTA)。置冰盒10min后離心1500r/min，10min，棄上清液，收集底部細(xì)胞層。0.01mol/LpBS洗2次后，置含5％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為106/mL。細(xì)胞離心機(jī)(Shadon)甩片，純酒精(4℃預(yù)冷)固定5min，－20℃保存?zhèn)溆谩IF結(jié)果判定中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)呈亮綠色熒光，在細(xì)胞核核葉之間有重染者為胞漿型ANCA(c-ANCA)；熒光著色環(huán)繞細(xì)胞核周圍則為核周型ANCA(p-ANCA)。

2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)ANCA：參照Wiik[4]。6種特異性抗原：蛋白酶3、髓過(guò)氧化物酶、殺菌－通透性增高蛋白、彈力蛋白酶、組蛋白酶G和乳鐵蛋白分別用0.05mol/L碳酸鹽(pH9.6)緩沖液(BPI則用0.01mol/LpBS緩沖液)稀釋后包被酶標(biāo)板，終濃度為1～2μg/mL。χ2檢驗(yàn)比較SLE活動(dòng)期與穩(wěn)定期兩組患者ANCA的陽(yáng)性率。

3.免疫印跡法測(cè)定ANCA：1中性粒細(xì)胞粗抗原的制備：參照文獻(xiàn)[4]。取健康人的肝素抗凝血200ml，加預(yù)冷的4倍紅細(xì)胞溶解液；4℃，10min后離心，1500r/min,10min，棄上清液。底部沉淀打勻后，重復(fù)上述步驟一次。預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2次。加0.2mol/L醋酸鈉(pH4.2)10mL,PMSF(Sigma)終濃度1mmol/mL。超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎細(xì)胞(共10次，每次30s，中間間隔30s，冰浴中進(jìn)行)；4℃，12000r/min，離心20min；測(cè)上清液中的蛋白濃度；將上清液分裝入Ependorf管，冷凍干燥，－20℃保存?zhèn)溆谩?免疫印跡法：參照文獻(xiàn)[5]。

結(jié)果

1.IIF法：84份SLE患者血清，19份陽(yáng)性，均為p-ANCA，陽(yáng)性率22.6％。

2.ELISA法：84份SLE血清中無(wú)1例識(shí)別蛋白酶3、髓過(guò)氧化物酶或殺菌－通透性增高蛋白，只有2份識(shí)別彈力蛋白，12份識(shí)別乳鐵蛋白(14.3％)，37份識(shí)別組蛋白酶G(44.0％)。50份活動(dòng)期血清中，10份乳鐵蛋白陽(yáng)性(20.0％)，29份組蛋白酶G陽(yáng)性(58.0％)；而34份穩(wěn)定期血清分別只有2份乳鐵蛋白陽(yáng)性(5.9％)，8份組蛋白酶G陽(yáng)性(23.5％)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者具有顯著性的差異(P＜0.01)。

3.免疫印跡法：陽(yáng)性血清相對(duì)分子質(zhì)量為29000、78000的蛋白條帶，分別是特異性抗原組蛋白酶G和乳鐵蛋白。

討論

ANCA是近10年來(lái)國(guó)際上血管炎研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。研究表明，不同的ANCA類型和靶抗原往往與臨床上不同的疾病相關(guān)[6]。雖然有研究報(bào)道SLE中ANCA有一定的陽(yáng)性率，但是對(duì)靶抗原和其中的臨床意義存在爭(zhēng)議[1，2]。通常用IIF法檢測(cè)ANCA分為兩種類型：胞漿型ANCA，其靶抗原主要是PR3，還有一部分是BPI；核周型ANCA，其靶抗原主要是髓過(guò)氧化物酶，還有組蛋白酶G、彈力蛋白酶和乳鐵蛋白等。

近年來(lái)，有關(guān)ANCA在SLE中的研究涉及了檢測(cè)方法、特異性靶抗原、臨床意義等各個(gè)方面。由于SLE中ANA的陽(yáng)性率很高，與p-ANCA很難區(qū)別。應(yīng)注意選用淋巴細(xì)胞為底物作內(nèi)參照。ANA不僅可識(shí)別外周血單一核細(xì)胞，也識(shí)別淋巴細(xì)胞，而p-ANCA不識(shí)別淋巴細(xì)胞內(nèi)的成分。但是，當(dāng)ANA和ANCA同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，ANA的熒光很強(qiáng)可掩蓋ANCA，與p-ANCA區(qū)分很困難。本研究中IIF法的陽(yáng)性率僅為22.6％，明顯低于ELISA法。因此應(yīng)用IIF法檢測(cè)SLE患者的ANCA僅可作為過(guò)篩，要通過(guò)ELISA法明確靶抗原。

本研究檢測(cè)了ANCA的6種已知抗原，84份SLE血清無(wú)1例識(shí)別髓過(guò)氧化物酶、殺菌－通透性增高蛋白，只有2例彈力蛋白酶陽(yáng)性，有12例乳鐵蛋白陽(yáng)性(14.3％)，37例組蛋白酶G陽(yáng)性(44.0％)，說(shuō)明SLE中ANCA的靶抗原主要是組蛋白酶G和乳鐵蛋白。并且活動(dòng)期組蛋白酶G和乳鐵蛋白的陽(yáng)性率明顯高于穩(wěn)定期。本組資料未發(fā)現(xiàn)ANCA陽(yáng)性與重要器官如腎臟受累有關(guān)；患者病程中出現(xiàn)皮膚血管炎改變與ANCA陽(yáng)性也無(wú)明顯關(guān)系。本組資料表明，IIF法檢測(cè)SLE患者血清中p-ANCA的陽(yáng)性率是22.6％，未見(jiàn)c-ANCA；特異性靶抗原主要是組蛋白酶G和乳鐵蛋白，組蛋白酶G的陽(yáng)性率可達(dá)到44.0％。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SLE病情活動(dòng)期組蛋白酶G和乳鐵蛋白的陽(yáng)性率明顯高于穩(wěn)定期，提示抗組蛋白酶G和乳鐵蛋白自身抗體可能與SLE的病情活動(dòng)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]SpronkPE,BootsmaH,HorstG,etal.antineutrophilcytoplasmicantibodiesinsystemiclupuserythematosus.BrJrheumatol,1996,35:625-631.

[2]SchnabelA,CsernokE,IsenbergDA,etal.Antineutrophilcytoplasmicantibodiesinsystemiclupuserythematosus:prevalence,speceficities,andclinicalsignificance.ArthritisRheum,1995,38:633-637.

[3]蔣明,朱立平,林孝義主編.風(fēng)濕病學(xué).第1版.北京:科學(xué)出版社,1995.1037.

[4]WiikA,RasmussenN,WieslanderJ.Methodstodetectautoantibodiestoneutrophilicgranulocytes.ManualBiolMarkersDis,1993;A9:1-14.

[5]ZhaoMH,JonesSJ,LockwoodCM.Bactericidal/permeability-increasingprotein(BPI)isanimportantantigenforanti-neutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)invasculitis.ClinExpImmunol,1995,99:49-56.

[6]GrossWL,CsernokE,HelmchenU.Antineutrophilcytoplasmicautoantibodies,autoantigen,andsystemicvasculitis(Review).APMIS,1995,103:81-97.

(收稿：1998－03－13修回：1998－08－20)

（責(zé)任編輯：zxwq）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的臨床意義

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