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中藥射干提取物對(duì)皮膚癬菌抑菌作用研究

發(fā)布時(shí)間： 2016-07-11 18:13:32 來(lái)源：健康族

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中藥射干提取物對(duì)皮膚癬菌抑菌作用研究

中華皮膚科雜志1998年第5期第31卷論著摘要

作者：劉春平王鳳榮南國(guó)榮四榮聯(lián)王剛生郭文友

單位：050051石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院(劉春平)；第二醫(yī)院(南國(guó)榮四榮聯(lián)王剛生郭文友)；河北醫(yī)科大學(xué)病理研究室(王鳳榮)

本實(shí)驗(yàn)選用中藥射干進(jìn)行研究，測(cè)定各部分提取物對(duì)5種常見(jiàn)皮膚癬菌的抑菌作用，以期為臨床采用射干提取物治療皮膚癬菌病提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料和方法

1.菌種：紅色毛癬菌(Tr)、須癬毛癬菌(Tm)、犬小孢子菌(Mc)、石膏樣小孢子菌(Mg)和絮狀表皮癬菌(Ef)各1株，均為購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所菌種保藏中心的標(biāo)準(zhǔn)株。

2.藥物、藥物提取及培養(yǎng)基制備：射干1000g，由本院中藥房提供。根據(jù)李應(yīng)勤等［1］的方法，取射干1000g粉碎后，以95%乙醇回流提取3次。合并提取液，加熱濃縮，得稠膏200g，加水溶解，濾去不溶物。水溶液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓回流，三部分得量分別是25g、9g和30g。取三部分提取物和前兩部分混和物(1∶1)各2g、2g、5g和2g，分別溶于3ml二甲基亞砜中，將4種溶液分別以沙堡瓊脂培養(yǎng)基稀釋至100ml做為初濃度，再倍比稀釋5次，得6個(gè)濃度的系列藥基。設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)應(yīng)濃度的二甲基亞砜對(duì)照組及空白對(duì)照組。冷藏備用。

3.抑菌效果觀察：將5種皮膚癬菌分別移種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7～14天，以手術(shù)刀刮取菌絲體，加入無(wú)菌生理鹽水，研磨，至形成菌懸液(菌絲長(zhǎng)度約為10～50μm)。離心(4000r/min，5分鐘)，棄上清液。取沉淀菌絲分別加入沙堡液體培養(yǎng)基中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)菌絲濃度為0.5～1.0×107CFU/ml。5種菌懸液分別振蕩混勻，接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基斜面的底部，接種量10μl，平行樣品3管。試管直立放置，25℃培養(yǎng)2周。3管均無(wú)生長(zhǎng)為陰性，陰性管的最低藥物濃度為對(duì)該菌的最小抑菌濃度(MIC)。同時(shí)記錄陽(yáng)性管中菌絲體高度(cm)，以觀察有無(wú)量效反應(yīng)關(guān)系。

4.流式細(xì)胞術(shù)樣品制備及檢測(cè)：取抑菌效果最好的射干提取物，根據(jù)MIC以沙堡液體培養(yǎng)基為基質(zhì)，配制成藥液，挑取Tr菌落(沙堡瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)12天)邊緣菌絲體，浸泡于藥液。24小時(shí)取出，5%甲醛溶液固定，剪碎，加入0.5%鹽酸胃蛋白酶1ml，37℃消化15分鐘，邊消化邊吹打，消化后于高倍鏡下可見(jiàn)大量單體細(xì)胞。200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，低速離心去碎片，采用溴化乙啶一步插入性染色法進(jìn)行染色，500目銅網(wǎng)過(guò)濾，待測(cè)［2］[HT5”〗。同時(shí)設(shè)二甲基亞砜對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組平行樣品3份。以FACS420型流式細(xì)胞儀檢測(cè)，測(cè)量數(shù)據(jù)和圖形輸入HP-300Consort30計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。測(cè)定前以雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器的CV值在5.0%以?xún)?nèi)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用Poms軟件對(duì)陽(yáng)性管中菌絲體高度進(jìn)行直線相關(guān)回歸處理。以t檢驗(yàn)處理流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，并計(jì)算PI值［3］。

二、結(jié)果

1.射干提取物中乙醚部分對(duì)5種皮膚癬菌的MIC為1.25～2.5mg/ml。乙酸乙酯部分對(duì)Tr和Ef的MIC為20mg/ml，對(duì)其余3種菌在檢測(cè)范圍內(nèi)無(wú)效。正丁醇部分在檢測(cè)范圍內(nèi)對(duì)5種菌均無(wú)效?；旌臀锏腗IC為1.25～2.5mg/ml，對(duì)Tr、Tm和Mg的抑菌作用略強(qiáng)于乙醚部分，對(duì)Mc和Ef的抑菌作用等同于單純乙醚部分。

2.乙醚部分抗5種皮膚癬菌各管生長(zhǎng)情況及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理見(jiàn)附表。由附表中可以看出，乙醚部分對(duì)5種皮膚癬菌的抑菌作用均有量效反應(yīng)關(guān)系。

附表不同濃度射干乙醚提取物抗5種皮膚癬菌各管生長(zhǎng)情況

(菌絲體高度)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(cm)

皮膚癬菌0.625mg/ml1.25mg/mlrY=a+bxP123123紅色毛癬菌0.5*0.40.3000-0.9608Y=0.8-0.64x＜0.01須癬毛癬菌10860.60.50.4-0.7662Y=8.25-3.7143x＜0.05石膏樣小孢子菌6.565.51.11.00.9-0.845Y=6.5-2.8571x＜0.01犬小孢子菌2.521.5000-0.9608Y=4-3.2x＜0.01絮狀表皮癬菌0.30.20.1000-0.866Y=0.4-0.32x＜0.01注：提取物濃度為2.5、5.0、10.0、20.0mg/ml時(shí)5種皮膚癬菌各管均陰性。輸入數(shù)據(jù)取至出現(xiàn)陰性結(jié)果的第1大組(如Tr輸入6組數(shù)據(jù))3.取乙醚部分MIC的最高值2.5mg/ml配制藥液。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物作用后TrS期DNA含量增高，與兩對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。兩對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。三組的PI值分別為：實(shí)驗(yàn)組53.95%，二甲基亞砜對(duì)照組38.33%，空白對(duì)照組38.11%，各組之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

三、討論

中藥射干屬于鳶尾科植物射干的干燥根莖［4］。關(guān)于射干抑制皮膚癬菌的研究已有報(bào)道，但均用射干全藥。本實(shí)驗(yàn)依射干藥用成分極性的增強(qiáng)，將其分別提取于乙醚、乙酸乙酯和正丁醇中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，射干的乙醚部分提取物對(duì)5種常見(jiàn)皮膚癬菌的抑菌效果最好，具有量效反應(yīng)關(guān)系。表明射干中極性小的親脂性成分是其抗皮膚癬菌的有效成分。

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)已應(yīng)用于真菌領(lǐng)域有關(guān)研究。皮膚癬菌通常狀態(tài)下以菌絲形式存在，本實(shí)驗(yàn)用0.5%鹽酸胃蛋白酶對(duì)其進(jìn)行消化，從而將多細(xì)胞形式的菌絲變成細(xì)胞單體。經(jīng)藥物作用后，Tr的DNA含量增高，有較強(qiáng)的增殖活性，可能是Tr遇到不利條件時(shí)，為了生存出現(xiàn)的代償性變化，或可能菌絲細(xì)胞不全有核，制成單體后，各期帶核的細(xì)胞數(shù)不一致等因素所致，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1李應(yīng)勤,陸蘊(yùn)茹,魏璐雪.白射干黃酮類(lèi)成分的研究.藥學(xué)學(xué)報(bào),1986,21∶836-841.

2左連富.流式細(xì)胞術(shù)與生物醫(yī)學(xué).第1版.沈陽(yáng):遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,1996.68-73.

3李蔭英,朱永德,鄭力芬,等.應(yīng)用FCM和TEM分析人胚肺二倍體細(xì)胞.中華物理醫(yī)學(xué)雜志,1992,14∶240-243.

4江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.第1版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991.1883-1885.

（責(zé)任編輯：zxwq）

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