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差別聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測艾滋病患者外周血前病毒DNA水平

中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著

作者：范雪莉徐文嚴(yán)范江李子仁閆小君陳若延

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈反應(yīng)；差別；艾滋??；前病毒

【摘要】目的為了評價(jià)艾滋病的治療效果、篩選有效治療藥物，了解患者體內(nèi)病情變化，常常需要對治療前后患者體內(nèi)病毒水平進(jìn)行客觀的定量。方法采用差別聚合酶鏈反應(yīng)，共同擴(kuò)增待測靶基因HIV-1gag和參照模板β-globin基因，建立起檢測HIV-1復(fù)制水平的定量方法，并對8例艾滋病患者外周血前病毒DNA含量進(jìn)行定量。結(jié)果8例患者的前病毒DNA水平介于0.508～2.210拷貝數(shù)/μgDNA之間，其復(fù)制和整合水平存在差異。結(jié)論該方法具有快速、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于典型的臨床標(biāo)本的檢測，為艾滋病療效判定提供客觀依據(jù)。

DifferentialPolymeraseChainReactionforQuantitationofHIVDNAinPeripheralBloodMononuclearCellofAIDSPatientsFanXueli,XuWenyan,FanJiang,etal.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042

【Abstract】ObjectiveInordertoevaluatethetherapeuticeffect,toscreeneffectivedrugsforAIDS,andtofindoutthechangesofpatient'scondition,itisnecessarytodevelopanobjectivemethodtoquantitatethelevelsofviralloadofthepatientsbeforeandaftertreatment.MethodDifferentialPCR(D-PCR)wasusedtoco-amplifythetargetHIV-1gaggeneandreferencetemplateβ-globingene,soastodeterminethelevelofHIVreplicationquantitatively.ThelevelsofHIVDNAintheperipheralbloodmononuclearcellsof8patientswithAIDSweredeterminedquantitatively.ResultsThelevelsoftheprovirusofthe8patientsrangedfrom0.508-2.210copies/μgDNA,thereweredifferencesinthelevelsofreplicationandintegration.ConclusionItistheauthors′opinionthatthismethodiseasytocontrolwithanadvantageofreliability,quicknessandreproducibility,Itissuitabletomeasureclinicalspecimens,andprovidesanobjectiveevidencefortheevaluationofresponsestotherapeuticintervention.

【Keywords】PCR,differentialAIDSProvirus

在探索控制艾滋病的藥物及各種防治途徑的過程中，為了解病情變化，評價(jià)治療效果，常常需要對治療前后患者體內(nèi)病毒水平或核酸復(fù)制狀態(tài)進(jìn)行客觀地定量。常用的方法包括Southern、Northern印跡和點(diǎn)印跡雜交，但這些方法由于敏感性低而不能檢出基因劑量的微小差別［1］。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克服了上述缺點(diǎn)，可以分析極微量的DNA，并可同時(shí)擴(kuò)增多種序列，并發(fā)展成為一種理想的核酸定量方法。我們在普通PCR的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)體系中共同擴(kuò)增HIV-1靶基因和參照模板，建立起差別PCR(DifferentialPCR,D-PCR)方法用以檢測艾滋病患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)中前病毒DNA水平。

材料和方法

(一)標(biāo)本：患者外周血標(biāo)本共8份采集于北京等

作者單位：210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所［范雪莉(現(xiàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科)、徐文嚴(yán)、范江、李子仁、陳若延］；全軍基因診斷技術(shù)應(yīng)用研究所(閆小君)

地，其中7例為艾滋病患者，1例為HIV-1感染者，均經(jīng)初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)證實(shí)其抗HIV-1抗體陽性。所有標(biāo)本均在P3實(shí)驗(yàn)室處理提取DNA后運(yùn)輸。

(二)PBMC中DNA的提取：

1.PBMC的分離：抽取艾滋病患者(或HIV-1感染者)外周靜脈血5ml并用肝素抗凝，等體積生理鹽水稀釋后，將10ml淋巴細(xì)胞分層液緩慢加入血液層下方，2500r/min離心20分鐘后吸取中間層白細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次，離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml。

2.PBMCDNA的提取：取1×106個(gè)細(xì)胞于1.5mlEppendorf管，用U-SDS裂解緩沖液(含尿素、十二烷基磺酸鈉等)和PBS裂解細(xì)胞，再經(jīng)酚、氯仿、異戊醇抽提蛋白、乙醇沉淀核酸后真空干燥，將沉淀溶于100μlTE緩沖液中，紫外分光光度計(jì)中測定DNA含量，表示為μg/μl，DNA樣品的濃度=A260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000。

(三)引物的設(shè)計(jì)：靶基因的擴(kuò)增選擇HIV-1的高度保守區(qū)域gag基因，引物的序列為JF1：TGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACAT和JF2：TAGTCTTACAATCTGGGTTCGCAT，擴(kuò)增片段的長度為314bp。參照基因選用單拷貝順序的人類β-珠蛋白(β-globin)基因，引物的序列為Po1：CAACTTCATCCACGTTCA

CC和Po2：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，擴(kuò)增片段的長度為268bp［2］。

(四)差別PCR反應(yīng)：在0.5ml高壓滅菌的Eppendorf管內(nèi)加入10×PCR緩沖液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs各2.5μl，引物JF1、JF2和Po1、Po2的終濃度為0.4μmol/L，再加入模板5μl，然后用三蒸水將總體積補(bǔ)至25μl；表面覆蓋30μl石蠟油，97℃預(yù)變性5分鐘后，加入TaqDNA聚合酶1U，混勻、離心，進(jìn)行熱循環(huán)，程序?yàn)椋?2℃，45秒；94℃，30秒；55℃，45秒，共40個(gè)周期，最后在72℃延伸5分鐘。

PCR產(chǎn)物部分經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)存在陽性條帶后，其余部分取10μl用于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行兩種條帶的分離，70V電壓條件下恒壓電泳4～6小時(shí)。最后將凝膠置于EB染色液(0.5μg/μl)或銀染色液中進(jìn)行染色，方法見有關(guān)文獻(xiàn)［3］；再于紫外或可見光源下觀察結(jié)果并照相，負(fù)片用于密度掃描。

(五)靶基因拷貝數(shù)的計(jì)算［4］：參照文獻(xiàn)按公式計(jì)算擴(kuò)增管中靶基因拷貝數(shù)=靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物量/β-Globin基因擴(kuò)增產(chǎn)物量。擴(kuò)增產(chǎn)物量指每一條帶經(jīng)LKBXL-222-020可見光激光密度掃描儀(瑞典)于室溫下掃描時(shí)直接讀出的各峰面積的積分相對值，可直接代入公式計(jì)算。最后結(jié)果即每一標(biāo)本中的精確拷貝數(shù)為：管中靶基因拷貝數(shù)(拷貝數(shù)/μl)÷樣品DNA濃度(μg/μl)；單位為：拷貝數(shù)/μgDNA。

結(jié)果

我們首先用β-Globin基因和HIV-1gag基因的引物分別對艾滋病患者的DNA標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，得到較為清晰的、泳動(dòng)速度有差別的兩種特異性條帶，分別為268bp和314bp，表明兩對引物擴(kuò)增患者標(biāo)本的PCR反應(yīng)體系均正常，反應(yīng)條件良好。然后將質(zhì)粒pBH10DNA(含HIV-1全基因)按一定比例稀釋至經(jīng)U-SDS裂解緩沖液提取的正常人PBMCDNA中，加入兩對引物在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，電泳后得到兩條能夠區(qū)分的條帶，但由于兩者分子量接近，因此在瓊脂糖凝膠電泳中分離時(shí)間較長。

對8例艾滋病患者標(biāo)本用D-PCR方法進(jìn)行HIV-1gag和β-Globin基因的共同擴(kuò)增后，經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后可觀察到兩條區(qū)分非常清晰的條帶；負(fù)片密度掃描后得到一具有兩個(gè)互不融合及交叉的波峰的清晰圖象。掃描所得到的各自波峰的面積即為每一條帶的強(qiáng)度值，按前述方法計(jì)算得出的每一標(biāo)本的拷貝數(shù)介于0.508～2.210/μgDNA(見附表)，表明每一患者的HIV-1DNA整合水平不同。

附表8例艾滋病患者外周血單一核細(xì)胞中前病毒DNA水平

病例號DNA濃度(μg/μl)密度強(qiáng)度比拷貝數(shù)/μgDNA10.6000.7201.19920.6500.1251.92330.5520.4470.89840.4450.9012.02450.4400.8892.21060.5700.3060.53070.4850.2790.50880.5500.5130.932討論

常規(guī)PCR存在其固有缺點(diǎn)，即只能給出陽性或陰性結(jié)果、鑒別目的DNA存在與否，不能反映基因量的變化，因此有許多作者采用同一管內(nèi)擴(kuò)增內(nèi)參照模板，以校正PCR反應(yīng)中管與管之間的差異［5］。

我們采用差別PCR方法對HIV-1感染者PBMC中前病毒DNA進(jìn)行定量，選用單拷貝順序的細(xì)胞基因β-Globin基因與靶基因在同一管中共同擴(kuò)增。對8例艾滋病患者PBMCDNA標(biāo)本分別進(jìn)行β-Globin和HIV-1gag基因擴(kuò)增，均得到陽性擴(kuò)增條帶，證明DNA標(biāo)本穩(wěn)定；進(jìn)一步將兩種引物在同一反應(yīng)管中雙重?cái)U(kuò)增，得到兩條區(qū)分清晰的條帶，表明反應(yīng)體系良好，而且由于用兩對引物同時(shí)擴(kuò)增位于不同位置的同一條模板，這樣任何影響PCR反應(yīng)的因素應(yīng)同時(shí)影響到兩種模板的擴(kuò)增。

國外曾有許多作者采用類似的方法來進(jìn)行基因水平的定量，如Lee等［6］[HT5曾選擇HLA-DQα基因作為內(nèi)參照模板也取得較為理想的結(jié)果。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，并且一次可將多份標(biāo)本同時(shí)檢測，非常適合于大樣本的藥物篩選。我們采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳使兩種條帶清楚地區(qū)分，然后用密度掃描儀對負(fù)片直接進(jìn)行掃描讀數(shù)，得出良好結(jié)果。盡管每份標(biāo)本間拷貝數(shù)差別較大，但它并不反映該方法的誤差，因?yàn)閷?shí)際上不同的患者之間病毒整合及復(fù)制水平是完全不同的，對同一(批)患者治療前后對比觀察是定量研究的意義所在。

當(dāng)然，本方法也存在其局限性，如只能求出相對量等。為克服這種差別PCR的缺陷，我們認(rèn)為有必要在此基礎(chǔ)上研制出更為客觀的競爭性定量PCR方法來對患者體內(nèi)病毒水平進(jìn)行定量研究，這一點(diǎn)將對艾滋病治療特別是我國中草藥的篩選有著極大的推動(dòng)作用。志謝本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院傳染科王愛霞教授、北京第二傳染病院徐蓮芝主任的大力幫助

參考文獻(xiàn)

1LewisDE,MinshallM,WrayNP,etal.ConfocalmicroscopicdetectionofHIV-1RNAproducingcells.JInfectDis,1990,162∶1373-1378.

2BauerHM,TingY,GreerCE,etal.GenitalhumanpapillomavirusinfectioninfemaleuniversitystudentsasdeterminedbyaPCR-basedmethod.JAMA,1991,265∶472-477.

3WidjojoatmodjoMN,FluitAC,ToblerLH,etal.RapididentificationofbacteriabyPCR-single-strandconformationpolymorphism.JClinMicrobiol,1994,32∶3002-3007.

4薛開先,王亞平,陳森清,等.差別PCR技術(shù)及檢測卵巢癌C-erb-B2癌基因擴(kuò)增的研究.癌變.畸變.突變,1995,7∶31-33.

5FanJ,BassHZ,FaheyJ.ElevatedIFN-γanddecreasedIL-2geneexpressionareassociatedwithHIVinfection.JImmunol,1993,151∶5031-5040.

6LeeTH,SunzeriFJ,ToblerLH,etal.QuantitativeassessmentofHIV-1DNAloadbycoamplificationofHIV-1gagandHLA-DQ-αgenes.AIDS,1991,5∶683-691.

（責(zé)任編輯：zxwq）

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