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梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（ETA-ABS-IgG）的建立

中華皮膚科雜志1999年第3期第32卷技術(shù)與方法

作者：任翊何君黃策劉德恭

單位：任翊劉德恭100054北京佑安醫(yī)院北京市性病防治所；何君黃策軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所一室

隨著免疫組化技術(shù)的建立和成熟，用酶標(biāo)抗體代替熒光抗體，就能用普通光學(xué)顯微鏡讀結(jié)果。我們依據(jù)免疫組化的理論，按FTA－ABS試驗(yàn)的原理建立了ETA－ABS－IgG試驗(yàn)，使梅毒螺旋體抗原染成棕黃色（DAB顯色）或紅色（AEC顯色），陽(yáng)性標(biāo)本在普通顯微鏡下清晰易辨。此外我們還用236例性病門(mén)診患者血清平行配對(duì)做ETAABSIgG試驗(yàn)及TPPA、RPR試驗(yàn)，現(xiàn)將ETAABSIgG試驗(yàn)的步驟及實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

一、材料與方法

(一)材料：

1.病例選擇：病例樣本取自北京市性病防治所1997～1998年門(mén)診患者血清共236份，56℃30min滅活補(bǔ)體后－20℃冷凍備存。樣本中男159例、女77例。按衛(wèi)生部疾病控制司梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，臨床排除梅毒的108例，臨床診斷梅毒的128例，其中一期梅毒40例，未治療33例，治療7例；二期梅毒56例，未治療27例，治療29例；早期潛伏梅毒18例，未治療12例，治療6例；病期不詳?shù)?4例。年齡（31.56±7.12）歲。

2.試劑：FTAABS試劑盒、Nichols標(biāo)準(zhǔn)梅毒螺旋體毒株抗原片，螺旋體Reiter株培養(yǎng)液吸收劑，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所一室提供。生物素標(biāo)記羊抗人IgG（22506），HRP－鏈霉親和素（D1030、F0811），封片劑Clearmount以及封閉用正常羊血清均購(gòu)自北京中山公司。TPPA試劑盒為日本富士產(chǎn)（VN80602），RPR試劑盒為新疆新地公司產(chǎn)。

3.自配試劑：PBS（pH7.4,0.01mol/L），醋酸緩沖液（pH5.2,0.15mol/L）,封閉劑（10％正常羊血清的PBS），樣本稀釋劑（1％BSA，10％正常羊血清，0.02％吐溫20的PBS），清洗劑（含0.08％吐溫20的PBS），酶稀釋劑（1％BSA，10％正常羊血清，0.04％吐溫20），DAB（DAB2.5mg,10mLPBS,0.1mL3％過(guò)氧化氫），AEC（4mgAEC，1mL二甲基甲酰胺，14mL醋酸緩沖液，0.15mL3％過(guò)氧化氫）。

（二）方法：

把梅毒螺旋體Nichols標(biāo)準(zhǔn)毒株兔睪丸接種培養(yǎng)，離心獲梅毒螺旋體作為抗原固定于載玻片上。用已滅活血清和樣本稀釋劑1∶20稀釋?zhuān)倥c吸收劑1∶1混合使最終樣本稀釋度為1∶40，然后37℃20min孵育，以去除交叉抗體。與此同時(shí)抗TP抗原片加20μL封閉劑37℃20min，以封閉空白位點(diǎn)。將已吸收的血清20μL加在抗原片上，37℃30min濕盒孵育，使TPIgG抗體與抗原結(jié)合。用清洗液浸泡清洗5min2次，期間提插抗原片數(shù)次，以洗去未結(jié)合的抗體。把1∶400稀釋的生物素化羊抗人IgG抗體20μL加在抗原片上，37℃20min，使其與抗TPIgG抗體結(jié)合。重復(fù)浸泡清洗5min2次。加1∶100稀釋的HRP－鏈親和素20μL，37℃20min，浸泡清洗8min2次。最后加底物DAB/AEC，結(jié)合上的HRP使DAB氧化呈棕黃色，AEC呈紅色。AEC顯色后需用封片劑Clearmount封片。

TPPA及RPR均按試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行。ETAABSIgG試驗(yàn)的判斷結(jié)果為：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下（×400）可見(jiàn)染成棕黃色或紅色的梅毒螺旋體，油鏡下（×1000）可見(jiàn)梅毒螺旋體呈細(xì)絲狀，兩頭尖，中間有排列均勻螺旋的典型形態(tài)；陰性標(biāo)準(zhǔn)：油鏡下（×1000）未發(fā)現(xiàn)染色的梅毒螺旋體；可疑標(biāo)準(zhǔn)為：DAB染色中，高倍鏡下（×400）可見(jiàn)染成棕黃色的螺旋體，但油鏡下（×1000）螺旋體形態(tài)不清晰。由于DAB顯色呈棕黃色，當(dāng)血清中抗TP抗體滴度低到一定水平，DAB顯色淺，結(jié)果與某些顯微鏡的黃光背景不易區(qū)分，所以先用DAB染色，對(duì)其中可疑病例再用AEC染色確定。

本研究用北京市性病防治所1997～1998年門(mén)診患者血清236份，平行配對(duì)由兩人分別做ETAABSIgG及TPPA、RPR，數(shù)據(jù)用SPSS軟件作配對(duì)χ2檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

用我們建立的ETABASIgG試驗(yàn)的方法檢測(cè)血清中抗TPIgG抗體，陽(yáng)性結(jié)果十分清晰易辨，在油鏡下（×1000）可以清楚地看見(jiàn)TP的典型形態(tài)。對(duì)236例樣本的配對(duì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1236份血清平行配對(duì)檢測(cè)TPPA和ETAABSIgG試驗(yàn)的結(jié)果比較

ETA-ABS-IgG試驗(yàn)與TPPA試驗(yàn)檢測(cè)合計(jì)χ2值＋－TPPA試驗(yàn)＋12531280.125－5103108P＞0.05合計(jì)130106236表2236份血清平行配對(duì)檢測(cè)RPR和ETA－ABS－IgG試驗(yàn)的結(jié)果比較

ETA-ABS-IgG試驗(yàn)與TPPA試驗(yàn)檢測(cè)合計(jì)χ2值+-RPR試驗(yàn)＋102010226.036－28106134P＜0.01合計(jì)130106236表3ETA－ABS－IgG試驗(yàn)與RPR試驗(yàn)對(duì)各期梅毒的敏感性

臨床分期例數(shù)(n)ETA-ABS試驗(yàn)(％)RPR試驗(yàn)(％)一期梅毒40未治療3310075.8治療710071.4二期梅毒56未治療27100100治療2996.679.3早期潛伏18未治療1210083.3治療683.350.0病期不詳1492.964.3合計(jì)12897.679.7本文所用縮寫(xiě)：ETA－ABS－IgG：梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)，F(xiàn)TA－ABS：熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)，TPPA：梅毒螺旋體乳膠凝集試驗(yàn)，RPR：快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)，PBS：磷酸緩沖液，HRP：辣根過(guò)氧化物酶，DAB：二氨基聯(lián)苯胺，BSA：牛血清白蛋白PA試驗(yàn)相比ETA－ABS－IgG試驗(yàn)的特異性為95.3％，敏感性為97.6％。其中TPPA陽(yáng)性但ETA－ABSIgG陰性的3份血清，推測(cè)是由于標(biāo)本中TP特異性抗體濃度太低所致，當(dāng)樣本稀釋度升高到1：10～1：20時(shí)這3份血清ETA－ABS－IgG試驗(yàn)結(jié)果均呈現(xiàn)陽(yáng)性。另外TPPA陰性而ETAABSIgG陽(yáng)性的5份血清，考慮是由于非特異性染色所致，由于TP抗原片中不可避免地有兔蛋白污染，而且TP有吸附蛋白的特性，雖經(jīng)封閉羊抗人IgG抗體仍有可能與兔蛋白結(jié)合造成假陽(yáng)性。而ETAABSIgG試驗(yàn)與RPR試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性，它與RPR對(duì)各期梅毒的敏感性見(jiàn)表3。

本次實(shí)驗(yàn)中，ETAABSIgG試驗(yàn)對(duì)治療后二期梅毒的敏感性為96.6％，小于一期梅毒和未治療二期梅毒的100％。理論上抗TPIgG抗體一旦形成可維持終身，但臨床上發(fā)現(xiàn)隨著及時(shí)的有效治療和病程的延長(zhǎng)，抗TPIgG抗體的血清滴度可逐漸下降，有些可下降到現(xiàn)有試劑盒不能檢測(cè)的水平，所以本實(shí)驗(yàn)中ETAABSIgG試驗(yàn)對(duì)二期梅毒的敏感性低于一期梅毒?？筎PIgG抗體滴度的下降，也可從ETAABSIgG試驗(yàn)對(duì)治療后早期潛伏梅毒的敏感性?xún)H為83.3％看出。

三、討論

目前雖然各國(guó)之間梅毒流行的情況差別很大，但梅毒依舊是十分重要的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題[2]，而梅毒的防治關(guān)鍵在于早期診斷，所以梅毒的早期、特異、敏感、簡(jiǎn)便并且易于推廣的檢測(cè)方法仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。對(duì)此，國(guó)外已利用人工合成梅毒抗原（Tpp15，Tpp17和Tpp47）設(shè)計(jì)出各種快速診斷試劑盒，如SyphilisFast[3]和ICESyphilisEIA[4]，其敏感性、特異性分別達(dá)93％、99.8％和99％、99.8％，而國(guó)內(nèi)在合成梅毒抗原之前，對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改良，提高早期梅毒的檢出率亦有臨床意義，所以我們用免疫組化技術(shù)對(duì)FTAABS試驗(yàn)進(jìn)行改良，建立了ETAABSIgG試驗(yàn)，使之能在普通顯微鏡下讀結(jié)果，并且利用不同底物產(chǎn)生的不同顯色效果，不僅結(jié)果清晰易辨，而且通過(guò)相互參照，可以最大程度地減少主觀差異，提高對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可疑病例判斷的準(zhǔn)確性。

ETA－ABS－IgG試驗(yàn)作為梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的一種，它的敏感性為97.6％，特異性為95.3％，與TPPA試驗(yàn)相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異，可替代TPPA試驗(yàn)作為梅毒血清學(xué)診斷的確認(rèn)試驗(yàn)，而且ETA－ABS法可在不增加設(shè)備的前提下，檢測(cè)抗TPIgM抗體，以及對(duì)硬下疳壓片進(jìn)行免疫染色檢驗(yàn)梅毒螺旋體，從而提高梅毒的早期診斷率，所以ETAABS法更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。而RPR試驗(yàn)在本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)于二期未治療的梅毒敏感性尚高，但由于反應(yīng)素一般在硬下疳出現(xiàn)后4周才陽(yáng)轉(zhuǎn)，經(jīng)有效抗梅治療后滴度迅速下降，所以RPR試驗(yàn)對(duì)于一期梅毒和已治療梅毒的敏感性低于80％。在臨床中一期梅毒和經(jīng)過(guò)各種抗生素治療的梅毒卻最為常見(jiàn)，所以非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)作為初篩試驗(yàn)越來(lái)越不能滿足臨床早期診斷的需要，必須推廣梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)以提高檢出率。作為梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)的一種，ETAABSIgG試驗(yàn)對(duì)一期梅毒和未治療的二期梅毒、早期潛伏梅毒的敏感性達(dá)100％，高于RPR試驗(yàn)的敏感性，并且與RPR試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，所以從提高梅毒檢出率的角度，ETAABSIgG試驗(yàn)優(yōu)于RPR試驗(yàn)，有利于梅毒的早期診斷。

對(duì)于底物的選擇，DAB與AEC各有利弊。DAB產(chǎn)物穩(wěn)定，無(wú)須封片即可在油鏡下讀結(jié)果，但DAB有致癌性，黃褐色產(chǎn)物不易與某些顯微鏡的黃光背景相區(qū)分；AEC產(chǎn)物呈紅色，在黃光和藍(lán)光背景中很醒目，但其產(chǎn)物十分不穩(wěn)定，易溶于酒精和油類(lèi)制劑，在油鏡下讀結(jié)果必須封片?？傊?，ETAABSIgG試驗(yàn)克服了FTAABS試驗(yàn)必須依賴(lài)熒光顯微鏡的弊端，但廣泛臨床應(yīng)用需更大的樣本檢驗(yàn)該方法。

參考文獻(xiàn)

1衛(wèi)生部防疫司.性病防治手冊(cè).第2版.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1994.9－12.

2DrusinLM.Syphilismakesacomeback.IntJSTDAIDS,1996,7:7－9.

3YoungH,MoyesA,DeSteCroixI,etal.Anewrecombinantantigenlatexagglutinationtest(syphilisfast)fortherapidserologicaldiagnosisofsyphilis.IntJSTDAIDS,1998,9:196－200.

4YoungH,MoyesA,SeagarL,etal.Novelrecombinantantigenenzymeimmunoassayforserologicaldiagnosisofsyphilis.JClinMicrobiol,1998,36:913－917.

(收稿：1998－11－06修回：1999－01－25)

（責(zé)任編輯：zxwq）

梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（ETA-ABS-IgG）的建立

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