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降鈣素基因相關(guān)肽在銀屑病斑塊型皮損的分泌與表達(dá)

臨床皮膚科雜志2000年第4期第29卷臨床及實(shí)驗(yàn)研究

作者：何焱玲丁桂鳳候凌飛鄧玉蘭王憲朱鐵君范少光

單位：朱鐵君何焱玲（北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科，北京100044）；鄧玉蘭丁桂鳳（北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，北京100083）；王憲候凌飛（北京醫(yī)科大學(xué)心血管研究所，北京100083）；范少光（北京醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，北京100083）

關(guān)鍵詞：銀屑??；神經(jīng)肽；降鈣素基因相關(guān)肽

摘要：為了解精神心理刺激誘發(fā)加重銀屑病的原因，探討神經(jīng)肽在銀屑病發(fā)病機(jī)理中的

作用。研究了降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在銀屑病皮損中的分泌與表達(dá)，并確定CGRP作用

的靶細(xì)胞。應(yīng)用特異性放射免疫反相法分析，測(cè)定32例尋常型銀屑病慢性斑塊型皮損組

織提取液中CGRP的含量，用抗生物素蛋白生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物法和兔抗人

CGRP抗體進(jìn)行免疫組化染色，觀察CGRP分泌表達(dá)的部位和作用的靶細(xì)胞。結(jié)果尋常型銀

屑病慢性斑塊型皮損組織提取物中CGRP的含量高于正常人，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異

(P＜0.01)。同時(shí)免疫組化染色形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CGRP分泌表達(dá)于皮損真皮毛細(xì)血管壁周及內(nèi)

皮細(xì)胞表面，以及表皮細(xì)胞間和樹枝狀細(xì)胞表面。提示尋常型銀屑病斑塊型皮損局部神

經(jīng)肽CGRP的分泌增加，皮損真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞和表皮樹枝狀細(xì)胞與神經(jīng)肽CGRP密切接

觸。CGRP與銀屑病局部病變密切相關(guān)。

中圖分類號(hào)：R758.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4963(2000)04

Expressionandsecretionofcalcitoningenerelatedpeptideinpsoriaticplaquelesions

HEYanling,ZHUTiejun

（DepartmentofDermatology,People'sHospital,BeijingMedicalUniversity,Beijing100044，China）

DINGGuifeng

（DepartmentofImmunology,BeijingMedicalUniversity,Beijing100083,China）

HOULingfei,WANGXian

（InstituteofCardiovascularDisease,BeijingMedical

University,Beijing100083,China）

DENGYilan,FANShaoguang

（DepartmentofPhysiology,BeijingMedicalUniversity,Beijing100083,China)

Abstract:Inordertostudythemechanismoftheeffectofstressonpsoriasisandtheinvolvementofneuropeptidesinpsoriaticpathogenesis,weinvestigatedtheexpressionandsecretionofcalcitoningenerelatedpeptide(CGRP)inpsoriaticplaque

lesions,thenidentifiedthetargetcellsofCGRPinpsoriaticplaquelesions.Specificradioimmunoassay(RIA)wasusedtodetermineCGRPsecretivecontentandimmunohistochemistrystainingwithbiodinavidinperoxidasecompoundmethodtoobservethetargetcellsofCGRPinpsoriaticplaquelesiontissueof32casesofpsoriasisvulgaris.TheresultsshowedthatthecontentofCGRPinpsoriaticplaguelesionswashigherthanthatofnormalcontrols(P＜0.01).CGRPwasalsofoundonperiphlyandtheendothelialcellsofthedermalcapillariesandonthesurfaceofepidermaldendritecellsinpsoriaticplaquelesions.ItindicatedthatpathogenesisofpsoriaticplaquelesionswasrelatedtotheoverexpressionofneuropeptideCGRP,whichcloselycontactedwiththedermalmicrovascularendothelialcellsandepidermaldendritecellsinpsoriaticplaquelesion.

KeyWords:Psoriasis;Neuropeptide;Calcitoningenerelatedpeptide

精神心理刺激和應(yīng)激反應(yīng)可誘發(fā)和加重銀病，而且在緊張狀態(tài)下銀屑病皮損的神經(jīng)肽含量增加[1]。作為皮膚重要神經(jīng)遞質(zhì)的降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptid,CGRP)與表皮和真皮的多種靶細(xì)胞接觸，其功能還不清楚。但有研究提示CGRP可能直接影響皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、郎格漢期細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[2～5]。為了解精神心理刺激誘發(fā)加重銀屑病的原因，探討神經(jīng)肽CGRP在銀病發(fā)病中的作用，我們研究了CGRP在尋常型銀屑病患者斑塊型皮損中的分泌與表達(dá)、CGRP作用的靶細(xì)胞，獲得了有意義的結(jié)果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病例：活檢組織取材于32例尋常型銀屑病患者軀干和四肢伸側(cè)持續(xù)存在的慢性斑塊型皮損，女11例，男21例；年齡平均42例(20～65歲)；病程平均17年(2～35年)。正常對(duì)照組取材于28名正常人相應(yīng)部位的皮膚。

1.1.2試劑與儀器：hCGRP抗體和125I－CGRP(由北京醫(yī)科大學(xué)王憲教授惠贈(zèng)，分別購(gòu)自美國(guó)半島公司和英國(guó)Amersham公司)：放免緩沖液(0.1％BSA,0.01％NaN3,5mmol/LNaCl和0.1％TTritonX－100的0.1mol/LPBS)；ABC免疫組化試劑盒(購(gòu)自中山生物試劑公司)；低溫離心機(jī)(CPKR型，美國(guó)BECKMAN公司)；γ－計(jì)數(shù)器(1470型，瑞士WALLAC公司)；冷凝濃縮干燥機(jī)(GIT100型，美國(guó)SAVANT公司)；DMRIXA顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1特異性放射免疫分析：CGRP放射免疫分析測(cè)定采用特異性放射免疫反相法[6]進(jìn)行。分別取銀屑病慢性斑塊型皮損及正常人對(duì)照組的皮膚組織約100mg(濕重)，放于1mol/L冰醋酸2mL，100℃煮沸10min，研磨制成組織勻漿，在4℃以4000r/min離心20min，取上清液1mL/管，放入待測(cè)試管，經(jīng)真空干燥后，儲(chǔ)存于－20℃。

將收集的干燥待測(cè)樣本以200μL放免緩沖液復(fù)溶。樣本和CGRP標(biāo)準(zhǔn)品與兔抗人CGRP抗血清(100μL/管)于4℃孵育24h，再加入125I－CGRP(100μL/管)混勻后于4℃孵育24h，加入放免緩沖液分離劑(1mL/管)，在4℃放置25min，使結(jié)合的125I－CGRP與游離的分離，再于4℃以3000r/mon離心20min，棄上清液，用γ－計(jì)數(shù)儀測(cè)定沉淀中125I的放射性強(qiáng)度。以2.5～1000pg/管的系列CGRP標(biāo)準(zhǔn)品(以pg為單位)，分別測(cè)其放射性強(qiáng)度與總管比較，通過(guò)γ－計(jì)數(shù)儀繪制CGRP標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步計(jì)算樣品中CGRP的含量(單位為pg)，放免最低監(jiān)測(cè)濃度為2.5pg。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色：用常規(guī)的免疫組織化學(xué)染色方法，取尋常型銀屑病軀干及四肢伸側(cè)斑塊型皮損組織及對(duì)照組正常人的皮膚組織，10％中性福爾馬林液固定，石蠟包埋連續(xù)切片(5μm)，常規(guī)脫蠟至80％酒精，3％H2O2甲醛封閉15min，經(jīng)微波爐修復(fù)抗原后，用血清封閉在37℃孵育20min，加入1∶500兔抗人CGRP抗體，于4℃孵育過(guò)夜后，滴入1∶200生物素化羊抗兔IgG抗體，在37℃孵育30min，常規(guī)TBS清洗，加1∶100ABC液，于37℃孵育50min，DAB－H2O2染色，蘇木素復(fù)染封片。以PBS和未免疫兔血清代替一抗作陰性對(duì)照，用鼠脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：CGRP放射免疫分析檢測(cè)后的結(jié)果數(shù)據(jù)x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)處理的結(jié)果，取雙尾t值和p值。

2結(jié)果

2.1皮損組織中CGRP的含量測(cè)定：應(yīng)用特異性CGRP放射免疫分析測(cè)定，尋常型銀屑病慢性斑塊型皮損組織提取物中的CGRP含量為27.31pg/200μL，正常人對(duì)照組相應(yīng)部位皮膚組織提取物的CGRP含量為13.47pg/200μL，經(jīng)t檢驗(yàn)，t=2.01,P＜0.01，兩者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(見表1)，表明尋常型銀屑病慢性斑塊型皮損組織的CGRP含量高于正常人對(duì)照組。

表1銀屑病斑塊型皮損及正常人皮膚組織CGRP含量檢測(cè)結(jié)果(pg/200μL)

分組例數(shù)(n)x±st值p值正常人2813.47±1.65－－銀屑病人3227.31±4.412.01＜0.012.2皮損組織中CGRP免疫組化染色形態(tài)學(xué)觀察：在尋常型銀屑病斑塊型皮損中，可見CGRP分布于增厚的表皮和真皮乳頭及淺層組織。在真皮乳頭毛細(xì)血管壁周及內(nèi)皮細(xì)胞有陽(yáng)性顆粒分布其表面，真皮淺層灶炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域的小血管叢間可伴行的神經(jīng)纖維表達(dá)分泌CGRP。在表皮見呈樹枝狀的CGRP陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞表面有分枝突起。經(jīng)連續(xù)切片做HE染色，未顯示此陽(yáng)性細(xì)胞，提示其可能為郎格漢斯細(xì)胞。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)在銀屑病斑塊型皮損中，CGRP陽(yáng)性的神經(jīng)纖維伸入到表皮內(nèi)，可見呈條索狀排列的陽(yáng)性表達(dá)顆粒(圖1)。在正常皮膚組織切片未發(fā)現(xiàn)同樣的CGRP陽(yáng)性顆粒。用正常兔血清代替CGRP結(jié)果為陰性。

圖1銀屑病斑塊皮損CGRP陽(yáng)性的神經(jīng)纖維伸入表皮內(nèi)，

可見呈條索狀排列的陽(yáng)性表達(dá)顆粒

3討論

降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種含37個(gè)氨基酸殘基的神經(jīng)肽，1982年Amara[7]首次在人和哺乳物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，由降鈣素基因編碼，轉(zhuǎn)錄合經(jīng)不同的剪接接修產(chǎn)生組織特異性的降鈣素和CGRP，前者存在于甲狀腺C細(xì)胞，而CGRP則廣泛在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。在外周神經(jīng)系統(tǒng)，CGRP主要由感覺神經(jīng)元合成，分布于無(wú)髓鞘的C纖維，存在于人體皮膚。表皮下有單個(gè)散在CGRP反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維，能穿透基底膜進(jìn)入表皮，真皮深層CGR性神經(jīng)纖維可從神經(jīng)束中伸出分枝，到達(dá)小血管和汗腺周圍，釋放CGRP，調(diào)節(jié)其功能，CGRP成為皮膚重要的感覺神經(jīng)遞質(zhì)[3]。

由于CGRP既是一種有效的血管活性劑，有較強(qiáng)的舒張微血管作用，又能刺激人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(humandermalmicrovascularendothelialcell,HDMEC)活化，使HDMEC分泌趨化因子IL－8，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單一核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的粘作用[5]。因此，CGRP在一系列炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)特異性放射免疫分析結(jié)果表明，銀屑病斑塊型皮損局部組織CGRP的含量27.31pg/200μL，而正常人為13.4pg/200μL，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩者有顯著性差異，說(shuō)明尋常型銀屑病患者斑塊型皮損神經(jīng)肽CGRP的分泌量比正常人升高。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Farber的報(bào)道[1,8]相符合。

為了確定CGRP在銀屑病在患者斑塊型皮損區(qū)分泌表達(dá)的部位和作用的靶細(xì)胞，我們用抗生物素蛋白－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物法，進(jìn)行免疫組化染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真皮毛細(xì)血管壁周及內(nèi)皮細(xì)胞表面有CGRP陽(yáng)性顆粒分布，真皮淺層灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域的微血管叢間，有伴行的神經(jīng)纖維分泌表達(dá)CGRP。而且，增厚的表皮內(nèi)見條索狀排列的陽(yáng)性表達(dá)顆粒和樹枝狀的陽(yáng)性細(xì)胞，并經(jīng)連續(xù)切片HE染色為陰性，提示可能為郎格漢斯細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了雙相免疫熒光及激光共聚焦掃描，證實(shí)CGRP陽(yáng)性的樹枝狀細(xì)胞是CD1＋的郎格漢斯細(xì)胞(另文發(fā)表)。由此可見，神經(jīng)肽CGRP在銀屑病變過(guò)程中，對(duì)擴(kuò)張微血管，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，影響靶細(xì)胞的功能，可能具有十分重要的作用。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)銀屑病斑塊型皮損的CGRP神經(jīng)纖維比正常皮膚增多了，一些CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維從真皮的末端進(jìn)入表皮。這表明銀屑病斑塊型皮損的病變與CGRP的過(guò)度分泌密切相關(guān)，但其作用如何有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2000-01-24；修回日期：2000-03-17

（責(zé)任編輯：zxwq）

降鈣素基因相關(guān)肽在銀屑病斑塊型皮損的分泌與表達(dá)

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