乙肝病毒X基因與肝癌

肝腫瘤；乙型肝炎病毒；X基因中國圖書館分類號R735.7Subjectheadingsliverneoplasms;hepatitisBvirus;Xgene目前公認(rèn)肝癌(HCC)的發(fā)病是多因素協(xié)同作用的結(jié)果，其中乙肝病毒(HBV)感染是HCC的主要病因之一.流行病學(xué)調(diào)查表明HBV感染者HCC的發(fā)病率較對照人群高出200倍以上.雖然HBV的確切致癌機制尚未完全闡明，但隨著分子病毒學(xué)的研究進展，人們對HBVX基因及其產(chǎn)物X蛋白(pX)與HCC之間的關(guān)系已有了多方面及多層次的了解，積累了大量研究資料.HBV基因組是一不全雙鏈的環(huán)狀DNA分子，其長鏈含有4個開放讀碼框架(ORF)，分別為編碼前S1蛋白，前S2蛋白及S蛋白的S基因，編碼前C蛋白與C蛋白的C基因，編碼DNA聚合酶蛋白的P基因，以及編碼pX的X基因.X基因是HBVDNA中最小的一個ORF，編碼基因區(qū)位于1374～1818核苷酸之間，其編碼的pX(或稱為乙肝病毒X抗原，HBxAg)由154個氨基酸組成.Kweeetal[1]研究表明X基因至少編碼Mr17000，8000和6600三種蛋白，基因分析顯示靠近5＇的AUG起始密碼開始的序列表達完整長度的Mr17000蛋白，即pX.Mr8000和Mr6600兩種蛋白是由框架內(nèi)起始密碼子編碼的兩種缺失氨基端部分序列的pX.三種蛋白在調(diào)控中的作用有所不同，只有Mr17000pX能激活NF-kB依賴性啟動子序列，而對SV40的增強子/啟動子序列的轉(zhuǎn)錄激活，Mr17000和Mr6600蛋白均為必需.可見X基因編碼的三種蛋白在功能上互相聯(lián)系，具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性.1X基因的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)基因研究X基因的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)基因研究使人們對X基因的致癌作用有了突破性認(rèn)識.1989年Shirakataetal首先發(fā)現(xiàn)通過X基因片段的表達載體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3誘發(fā)其體外轉(zhuǎn)化，經(jīng)裸鼠移植可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤.其后Luberetal[2]應(yīng)用X基因轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞系FMH202，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞克隆在軟瓊脂培養(yǎng)中出現(xiàn)惡性生長，形成的細(xì)胞集落移植到裸鼠后形成瘤灶.作者認(rèn)為X基因的表達及肝細(xì)胞的基因突變是導(dǎo)致HCC發(fā)生的主要原因.X基因轉(zhuǎn)基因研究中最引人關(guān)注的是Koikeetal[3]將X基因?qū)隒D-1小鼠系的胚胎細(xì)胞中，誘發(fā)84%的雄鼠肝臟腫瘤并伴有pX的高度表達.實驗小鼠在2月齡時圍繞中央靜脈周圍的肝細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)空泡樣變，伴有pX的高度表達，13月齡時小鼠出現(xiàn)癌灶.經(jīng)5-溴脫氧尿核苷標(biāo)記分析，病灶中肝細(xì)胞DNA的合成較對照明顯增加，且DNA含量分析顯示在癌灶出現(xiàn)前轉(zhuǎn)基因鼠的肝臟存在數(shù)個非整倍體峰.轉(zhuǎn)基因鼠的研究為X基因在HCC發(fā)病中的作用提供了直接的證據(jù).然而，并非所有的轉(zhuǎn)基因研究均能誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化.Reifenbergetal[4]將X基因?qū)隒57B/6J小鼠的胚胎中，經(jīng)長達2a的觀察后處死小鼠，組織學(xué)檢查顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟雖有X基因表達，但病理改變輕微，并無HCC的發(fā)生.Balsanoetal[5]的研究同樣未能在轉(zhuǎn)基因鼠中誘發(fā)HCC.對此，Koike[6]認(rèn)為能否在轉(zhuǎn)基因鼠中誘發(fā)HCC的關(guān)鍵是pX的持續(xù)高水平表達，而僅低水平的pX表達不足以導(dǎo)致HCC的發(fā)生.2X基因的反式激活作用1987年Twuetal發(fā)現(xiàn)與PUC9重組的X基因在猴腎細(xì)胞中可激活人β-干擾素基因的調(diào)控序列，使受此調(diào)控序列調(diào)控的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄增加，從而揭開了X基因反式激活作用研究的序幕.現(xiàn)已明確X基因的反式激活作用具有明顯廣譜性，pX作為一非特異性反式激活因子，對多種細(xì)胞與病毒的多種靶基因均具有反式激活作用[7，8].目前已知pX對多種癌基因具有反式激活作用，其中包括c-myc，ras,c-fos及c-jun等.此外，pX亦能激活胰島素樣生長因子受體Ⅰ，Ⅱ[16,17]及多藥耐藥基因.因此，人們有理由相信X基因通過其反式激活作用改變宿主基因的表達，導(dǎo)致HCC的發(fā)生.pX的反式激活機制非常復(fù)雜，主要是以細(xì)胞因子作為橋梁，通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)間接發(fā)揮其廣譜轉(zhuǎn)錄激活功能.與pX反式激活有關(guān)的細(xì)胞因子有AP-1，AP-2，NF-kB,EF-C及ATF/CREB等.目前已知pX可引起內(nèi)源性蛋白激酶C(PKC)活性物質(zhì)DAG增加，激活PKC后引起AP-1，AP-2及NF-kB等細(xì)胞因子活化，從而對靶序列發(fā)揮激活作用[9].另一方面，pX亦可通過激活Ras-Raf-MAP激酶鏈鎖反應(yīng)，引起AP-1及NF-kB活化，繼而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[10].此外，亦有研究顯示pX可直接作用于核內(nèi)組分引發(fā)轉(zhuǎn)錄激活[11]，或者與細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、蛋白酶復(fù)合物組分[12]抑或DNA修復(fù)蛋白[13]發(fā)生作用，從而發(fā)揮其反式激活作用.由此可見pX的反式激活存在多種途徑與方式.Ariietal[14]對pX的一級結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)pX的反式激活功能需要三個關(guān)鍵部位；第46～52氨基酸(特別是46脯氨酸、49組氨酸與52組氨酸)、第61～69氨基酸(特別是61半胱氨酸、67甘氨酸、68脯氨酸與69半胱氨酸)，以及第132～139氨基酸(特別是132苯丙氨酸、137半胱氨酸與139組氨酸)，這三段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守.第46～52氨基酸是形成組氨酸/天冬氨酸特征性功能結(jié)構(gòu)所必需，而第61～69氨基酸及第132～139氨基酸則與絲氨酸蛋白酶抑制有關(guān)的Kunitz區(qū)域類似，通過此相似結(jié)構(gòu)pX可直接抑制絲氨酸蛋白酶，從而阻斷絲氨酸蛋白酶的作用[15].因此，這兩種功能結(jié)構(gòu)對pX的反式激活功能至關(guān)重要，而第5～27氨基酸及第144～154氨基酸的缺失并不影響pX的反式激活功能.雖然目前對pX反式激活的途徑及功能結(jié)構(gòu)有所了解，但由于其作用機制的復(fù)雜性，人們尚缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識.3X基因與p53基因p53基因是一種腫瘤抑制基因，野生型p53具有維持細(xì)胞正常生長，抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用.當(dāng)細(xì)胞因物理或化學(xué)因素作用發(fā)生DNA損傷時，可通過p53啟動細(xì)胞凋亡過程，使有癌變傾向的細(xì)胞不再存活.p53基因的丟失或突變失活不但使其失去野生型p53的作用，而且可能具有癌基因的功能.1991年Hsuetal與Bressacetal分別報道了中國啟東和南非地區(qū)的HCC，發(fā)現(xiàn)在p53的249編碼區(qū)第三密碼子有一特征性點突變G→T顛換(249ser)，使原先的精氨酸被絲氨酸所代替，其突變率高達50%，這一結(jié)果曾被視為肝癌與p53關(guān)系研究中的重大突破.但隨后的研究表明此特征性G→T顛換主要由黃曲霉毒素B1引發(fā)，而與是否存在HBV感染關(guān)系甚微[16].此外，與HCC有關(guān)的p53突變尚有249met及220cys[17]，但似與HBV感染的聯(lián)系并不密切.在HBV與p53基因關(guān)系研究中引人注目的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)了pX有與P53蛋白結(jié)合的作用[18].由于pX與P53蛋白的結(jié)合可在蛋白水平使靶細(xì)胞中抑癌基因及其產(chǎn)物的功能發(fā)生改變，破壞了p53基因的負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[19，20].現(xiàn)已證實pX能有效阻斷p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]，其機制可能為通過p53功能的喪失，抑或干擾阻斷p53與TBP亞基TFIIH及p62亞基TFIID的聯(lián)系[22].Ghebraniousetal[23]通過p53246ser突變的轉(zhuǎn)基因鼠與表達HBV的轉(zhuǎn)基因鼠進行繁殖，并應(yīng)用黃曲霉毒素B1作用于后代，結(jié)果顯示13月齡的p53異常伴有HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的HCC發(fā)生率高達62%～100%，遠(yuǎn)較單純p53突變或HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的癌變率高，提示p53突變，HBV感染與黃曲霉毒素在HCC發(fā)病中有重要作用.然而，Ogueyetal[24]對鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12進行X基因與p53246ser突變基因的共轉(zhuǎn)染研究，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯的惡性轉(zhuǎn)化，這或許與AML12細(xì)胞系對p53突變及pX的作用不甚敏感有關(guān).4X基因與pX的表達HBVDNA整合入宿主細(xì)胞基因組是HCC遺傳學(xué)研究的重大發(fā)現(xiàn)之一.目前已知在HBV慢性感染的病程中，HBVDNA以低頻率隨機地整合入肝細(xì)胞基因組，在進行整合的同時常伴隨宿主DNA的缺失、重排與轉(zhuǎn)位，最終引起染色體畸變或結(jié)構(gòu)異常[25].在宿主肝細(xì)胞基因組，HBVDNA的整合部位不是單一的，它們隨機地分布于多條染色體上.然而，統(tǒng)計分析表明這種整合多發(fā)生在HBV基因組的X基因區(qū)域，因此X基因及其產(chǎn)物pX的表達研究引人注目.在肝癌組織中，X基因與pX表達的陽性率約為50%～90%[26，27].pX主要位于胞質(zhì)內(nèi)，部分位于胞核內(nèi)，且癌周組織的陽性率與癌內(nèi)相近，但pX在肝癌的表達遠(yuǎn)較乙肝后肝硬變及慢性乙肝為高，在分離培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞仍保持表達pX的特性.此外，約有40%～60%表達X基因或pX的肝癌，其HBsAg的表達為陰性[28]，提示部分血清HBsAg陰性患者其肝癌組織中仍有X基因的整合.pX在肝癌的表達亦常伴有p53的突變[29].由于X基因的整合與pX的表達既可見于癌細(xì)胞，也可見于部分尚無明顯癌變的肝細(xì)胞或無癥狀HBV攜帶者的肝細(xì)胞中，因此整合本身僅可能為致癌的起始因素.通過整合可使DNA結(jié)構(gòu)異常，在有輔助致癌因素的作用下可啟動癌基因的調(diào)節(jié)順序，或通過X基因的反式激活作用，使癌基因轉(zhuǎn)錄活性增強而最終導(dǎo)致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化.有鑒于此，有學(xué)者認(rèn)為pX的表達可視為HCC發(fā)生的先兆.有關(guān)pX的血清學(xué)檢測研究顯示無論在HCC抑或慢性乙肝患者的血清中，pX的檢出率均較其他乙肝標(biāo)志物為低，僅為10%～20%[30].這可能因pX是一個弱抗原，或者pX僅在細(xì)胞融解時才被釋放，因此肝癌細(xì)胞內(nèi)pX表達率與血清pX檢出率不呈平行關(guān)系.HCC的流行病學(xué)調(diào)查與實驗研究均表明HBV在HCC的發(fā)病中具有重要作用.然而，可長達30a的潛伏期也顯示HCC的發(fā)生是一個多步驟過程.雖然目前已知HBVX基因和pX與肝癌的關(guān)系密切，但迄今為止還有許多問題需要進一步研究，這包括X基因的反式激活機制，與宿主肝細(xì)胞DNA的整合以及與p53基因的關(guān)系等.有理由相信隨著X基因的深入研究，將會大大促進肝癌的防治水平.

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