柑桔皮總黃酮的提取及鑒別

黃鎖義，羅燕，張婧萱，王三艷，陸輝宇(1．右江民族醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，廣西百色533000；2．右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科班，廣西百色533000；3．右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)本科班，廣西百色533000)柑桔皮為蕓香科植物橘樹成熟果實(shí)的果皮，在我國有悠久的藥用歷史。柑桔樹是我國亞熱帶地區(qū)栽培最廣的果樹，它四季長青，樹枝優(yōu)美。柑桔果實(shí)全都是寶，其皮、肉都是正統(tǒng)的中藥。我國古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為：柑桔皮性味辛、微溫、無毒、人脾、肺經(jīng)，有理氣調(diào)中、燥濕消痰、行氣導(dǎo)滯的功效，具有消炎，抗?jié)儯志袄懙茸饔?。臨床上用于治療和預(yù)防感冒、治療膽結(jié)石、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、還可用于防治高血壓和動脈硬化。預(yù)防血栓的形成，降低膽固醇，減少心梗的發(fā)生，也可用于嘔吐、腹瀉、心腹氣痛的治療，以及抑制多種消化道腫瘤的生長、抗自由基等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明：柑桔皮中主要含有黃酮類化合物、類胡蘿卜素類、硫胺素、核黃素、膳食纖維等食用和藥用成分，特別是黃酮類化合物在柑桔皮中的含量尤為豐富，黃酮類化合物具有多種生理功能。研究證明柑桔皮具有很高的藥用價(jià)值，為了充分利用，避免資源的浪費(fèi)，我們對柑桔皮中總黃酮進(jìn)行提取及鑒別，本文方法未見文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)將其過程介紹如下。1材料與方法1．1材料①市售新鮮的柑桔取其皮。②試劑：95％乙醇AR；甲醇AR；三氯化鋁AR；鹽酸AR；氨水AR；正丁醇AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；鎂粉AR；乙酸鎂AR；氫氧化鈉AR；亞硝酸鈉AR；硝酸鋁AR；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定所)。③儀器設(shè)備：UV-755B紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠)；DZF．150小型真空恒溫干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；80-2離心沉淀器(上海分析器械廠)；ZF-I型三用紫外線分析儀(上海顧村電光儀器廠)。1．2方法1．2。1工藝流程柑桔皮中總黃酮提取工藝流程見圖l。1．2．2操作步驟取市售新鮮柑桔，取皮，洗凈，切碎，烘干，取135g，置于鋁鍋中，加蒸餾水煮沸3h。冷卻后進(jìn)行粗濾，對濾渣用上述方法進(jìn)行再浸取2次，將3次濾液合并，濾液用高速離心機(jī)分離15min，l500r／min。并進(jìn)行加熱濃縮(加熱溫度在85％左右)。濃縮冷卻后加入等體積95％乙醇，放入冰箱內(nèi)2h。用高速離心機(jī)進(jìn)行分離工5min，1500r／min。過濾得濾液濾渣，棄去濾渣。對濾液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮(加熱溫度在85~C左右)。待乙醇蒸發(fā)完后，將濃液置于真空干燥箱中干燥成疏松固體，粉碎得終產(chǎn)物。1．3定量實(shí)驗(yàn)一總黃酮的含量測定l．3．1實(shí)驗(yàn)原理采用硝酸鋁比色法。黃酮類物質(zhì)是以2一苯基并吡喃酮為母核的多羥基化合物，可與糖苷類物質(zhì)遇堿變成明顯黃色，其機(jī)制是黃酮類物質(zhì)在堿性條件下其苯吡喃酮的1，2碳之間的C—O鍵打開成查耳酮的檢測方法常用分光光度計(jì)法或液相色譜法。分光光度法以用黃酮與鋁離子在堿性與亞硝酸存在條件下形成黃酮的鋁絡(luò)合物，生成穩(wěn)定的黃色。黃色的深淺與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系，可以蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)樣)作對照，于500nm波長處比色定量測定。l．3．2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備①標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品200mg，置于100ml容量瓶中，加入95％乙醇溶液并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取lOm1置于100mⅡ容量瓶中，加入95％乙醇使成100mI，搖勻即得(每毫升含有無水蘆丁0．2mg)②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取對照溶液0。O，2．0，4．O，6．O，8．O，l2．0m1分置于50m1容量瓶中，各加95％乙醇12ml，加5％亞硝酸鈉溶液2．Oml，混勻，放置6min，再加10％硝酸鋁溶液2．0mI，放置6min，加5％氫氧化鈉溶液20m1，最后用95％乙醇稀釋至刻度，搖勻，以第一瓶為空白溶液，用UV-755B紫外可見分光光度計(jì)，在500nm上測定吸光度。結(jié)果見表1。根據(jù)上表得一回歸方程：A=1．2433C-O．008l，r=0．9991，n=5，其中截距一()．0081，斜率為l。2433。l．3．3提取物含量的測定精密稱定提取物l。500og，置索氏提取器中，加95％乙醇回流至無色(6—8h)，將提取液置于燒杯中，水浴加熱濃縮至干，再用熱水洗滌3次，將洗液移至分液漏斗中，并加無水正丁醇液萃取3到5次，每次10ml，合并萃取液于燒杯中，水浴蒸干，再加95％乙醇使溶解，并移于50ml容量瓶中，再加95％乙醇至刻度，搖勻。精密取10ml于50ml容量瓶中加95％乙醇至刻度，搖勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備操作測定吸光度，A=O．328。1．3。4顏色反應(yīng)紫外光下呈色反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，在可見光下呈淡黃色，在紫外光下呈淡藍(lán)色并有熒光斑點(diǎn)。濃氨水反應(yīng)：取該樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)诎彼戏窖?．5min，立即在紫外光下觀察，呈極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn)。三氯化鋁反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1％三氯化鋁乙醇溶液，吹干。在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點(diǎn)。乙酸鎂反應(yīng)：取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1％乙酸鎂甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黃色斑點(diǎn)。鹽酸一鎂粉反應(yīng)：取乙醇提取液1m1于試管中加鎂粉，再加入濃的鹽酸數(shù)滴(1次加入)，在泡沫處呈紫紅色。1．3．5紙層析取樣品溶液10μl點(diǎn)在濾紙上。用正丁醇：醋酸：水=4：1：5為展開劑，上行展開5h，取出晾干。噴1％氯化鋁乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可見熒光斑點(diǎn)。2結(jié)果A=0．328，根據(jù)回歸方程：A=]．2433C—O．0081，計(jì)算樣品中總黃酮的含量C：4．49％。回收實(shí)驗(yàn)：精密稱提取物1．5000g，加入蘆丁對照品]．000og，同前樣品測定方法操作測定吸光度，求出回收率為98．o％。3討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法工藝簡單，回收率為98．0％，利用本文所提供的提取、純化方法而得到的黃酮類物質(zhì)其純度較高。此方法采用全物理過程，無任何污染，且該方法操作簡單方便，是一條理想的從柑桔皮中提取黃酮類物質(zhì)的有效途徑。黃酮類化合物是一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能：消除疲勞、保護(hù)血管、防動脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能。黃酮類化合物具有抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松，它能清除自由基、超氧化物和羥基自由基、抑制脂質(zhì)過氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化抗衰老、抗輻射等作用。近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引入矚目。柑桔分布廣泛，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柑桔皮中含有較為豐富的黃酮。因此，柑桔皮具有廣泛開發(fā)和利用價(jià)值，值得綜合利用，加強(qiáng)資源開發(fā)。《時(shí)珍國醫(yī)國藥》

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