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銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡以及維A酸與欖香烯的影響

中華皮膚科雜志1999年第2期第32卷論著

作者：劉振祥李世蔭

單位：100083北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

關(guān)鍵詞：銀屑病；細(xì)胞死亡；維甲酸；欖香烯

【摘要】目的探討銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡以及維A酸與欖香烯對(duì)體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響。方法用TUNEL法測(cè)定28例銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞儀和DNA片段化觀察維A酸與欖香烯對(duì)體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果28例銀屑病患者中19例有大量凋亡細(xì)胞分布于表皮各層，另9例較少，分布于棘細(xì)胞層和顆粒層。濃度為1、5、10、20μg/mL的維A酸和濃度為20、40、60、80μg/mL的欖香烯可促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞凋亡。結(jié)論銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡異常增多，一定濃度的維A酸與欖香烯可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞凋亡。

ApoptosisofPsoriaticKeratinocytesandtheEffectsofRetinoic

AcidandElemeneonApoptosisofCulturedKeratinocytes

LIUZhenxiang,LIShiyin.

DepartmentofDermatology,ThirdHospitalofBeijingMedicalUniversity,Beijing100083

【Abstract】ObjectiveToinvestigateapoptosisofpsoriatickeratinocytesandtheeffectsofretinoicacidandelemeneonapoptosisofculturedkeratinocytes.MethodsApoptosisofpsoriatickeratinocytesandtheeffectsofretinoicacidandelemeneonapoptosisofculturedkeratinocyteswerestudiedwithTUNELmethod,flowcytometryandDNAfragmentationextraction.ResultsItwasfoundthattherewerealargenumberofapoptoticcellsthroughoutalllayersofpsoriaticepidermisin19of28patientsandrelativelysmallamountinupperepidermallayersin9of28patients.Retinoicacidatconcentrationsof1,5,10,20μg/mLandelemeneat20,40,60,80μg/mLcouldinduceapoptosisofculturedColo-16keratinocytesinvitro.ConclusionTheseresultsindicatethatthenumberofapoptoticcellsincreasedabnormallyinpsoriasis.RetinoicacidandelemeneatcertainconcentrationscouldinduceapoptosisofculturedColo-16keratinocytesinvitro.

【Keywords】PsoriasisApoptosisTretinoinElemene

近年來(lái)人們認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡不僅在皮膚發(fā)育、更新、平衡穩(wěn)定中起作用，在某些增殖性皮膚病如銀屑病中也表現(xiàn)異常。許多細(xì)胞的增殖都需要雙重信號(hào)，第一信號(hào)有引起細(xì)胞增殖或凋亡兩種可能性，第二信號(hào)決定細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)，若沒(méi)有第二信號(hào)的作用，細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[1]。因此，細(xì)胞增殖與凋亡密切相關(guān)。我們從細(xì)胞凋亡的角度探討銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖過(guò)度的機(jī)理，采用TUNEL法觀察銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的變化，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀和DNA片段化分析觀察不同濃度的維A酸和欖香烯體外誘導(dǎo)Colo-16細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)將研究報(bào)道如下。

材料和方法

皮膚標(biāo)本：28份銀屑病皮損石蠟標(biāo)本均選自北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科門診及住院確診的尋常型銀屑病患者(皆屬靜止期)，28例中，男18例，女10例，年齡18～42歲，平均24歲。4份對(duì)照標(biāo)本取自成型科手術(shù)的正常皮膚(4例皆為男性，平均年齡21歲)，所取皮膚標(biāo)本均獲患者的同意。

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16：日本北里大學(xué)醫(yī)學(xué)部皮膚科Hikaru博士惠贈(zèng)。全反式維A酸：上海藥物研究所產(chǎn)品。欖香烯乳：大連藥物研究所產(chǎn)品(5mg/mL)。

TUNEL法：切片常規(guī)脫蠟至水；0.2NHCl10min；蛋白酶K(100μg/mL)10min；末端標(biāo)記反應(yīng)：2mmol/LdNTP(Dig-dUTP)、5×TdT緩沖液、TdT酶、無(wú)菌水37℃2h；洗片；5％馬血清封閉；加抗Dig-ap復(fù)合物抗體(1∶500)37℃、30min；BCIP/NBT避光顯色。陽(yáng)性細(xì)胞為胞核染色質(zhì)呈紫藍(lán)色，陰性對(duì)照不加TdT酶，其余步驟同前。每例切片計(jì)數(shù)10～20個(gè)400倍視野，以平均每100個(gè)細(xì)胞中含凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)(AI)。

角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)：人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞培養(yǎng)于50cm2培養(yǎng)瓶，達(dá)到90％左右的融合單層時(shí)更換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，分別加入維A酸和欖香烯，使維A酸的終濃度為1、5、10、20μg/mL，欖香烯的終濃度為20、40、60、80μg/mL(參考文獻(xiàn)[4]所述劑量，略加調(diào)整)，培養(yǎng)24h。

流式細(xì)胞儀分析：將上述培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞制成1×106/mL單細(xì)胞懸液，離心棄上清液，加入1mL的PI(磷脂酰肌醇)染液，用FACS儀檢測(cè)亞二倍體峰所占的百分率，每樣本重復(fù)2次。DNA片段的提?。簩⑸鲜雠囵B(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞收集起來(lái)，常規(guī)提取DNA(加0.5μg/L溴化乙錠)，電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

結(jié)果

1.4例正常表皮僅在顆粒層能見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞。28例銀屑病患者中19例表皮可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞分布于表皮各層，9例表皮凋亡細(xì)胞較少，分布在棘細(xì)胞層和顆粒層。

2.流式細(xì)胞儀分析：從表1可見(jiàn)，維A酸和欖香烯皆可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16的凋亡，在一定范圍內(nèi)，濃度愈高，其AP峰愈大。

表1不同濃度維A酸及攬香烯誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡(±s)

組別亞二倍體細(xì)胞的百分含量(%)t值＊對(duì)照組16.87±0.88-維A酸1μg/mL21.96±0.427.385μg/mL24.68±0.908.7810μg/mL37.18±0.3130.7920μg/mL45.75±0.5639.16攬香烯20μg/mL19.78±0.134.6340μg/mL27.33±1.259.6060μg/mL40.66±1.3221.2180μg/mL48.23±0.7638.14＊與對(duì)照組比較t值

3.DNA片段化分析：從圖1、2中可見(jiàn)，不同濃度維A酸和欖香烯皆可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16的凋亡，其濃度愈高，作用愈明顯。圖1不同濃度維A酸誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，由DNA梯度圖可見(jiàn)維A酸濃度為5μg/mL時(shí)Colo-16細(xì)胞凋亡顯著

2不同濃度欖香烯誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，由DNA梯度圖可見(jiàn)欖香烯濃度為40μg/mL時(shí)，Colo-16細(xì)胞凋亡顯著

討論

我們用TUNEL法檢測(cè)銀屑病患者表皮的凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯多于正常表皮，這提示銀屑病患者表皮不僅增生過(guò)度，而且細(xì)胞凋亡也異常增多，這可能也是機(jī)體自身調(diào)節(jié)，拮抗表皮的過(guò)度增生，使銀屑病損害處自身保持病理性的動(dòng)態(tài)平衡，臨床上表現(xiàn)為增殖性紅斑和脫屑。

我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析和DNA片段的提取及瓊脂糖電泳，觀察不同濃度的維A酸和欖香烯對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)4種不同濃度的維A酸和欖香烯具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增高，凋亡細(xì)胞也增多。維A酸在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和成熟中起著重要的作用[2]，在表皮中既影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與分化，又影響表皮細(xì)胞凋亡[3]。欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取的抗癌有效成分，是以β－欖香烯為主要成分的欖香烯類化合物，實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)和臨床試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)，欖香烯對(duì)腫瘤有確切療效[4，5]。臨床上應(yīng)用欖香烯治療銀屑病亦見(jiàn)報(bào)道[6]。欖香烯與維A酸都具有抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的雙重作用，它們可能在較低濃度范圍內(nèi)主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在較高濃度范圍內(nèi)則主要抑制或殺傷細(xì)胞。細(xì)胞凋亡對(duì)機(jī)體維持平衡有很重要的功能，凋亡過(guò)程受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素的影響，通過(guò)誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，使機(jī)體處于穩(wěn)定狀態(tài)。

國(guó)家教委博士點(diǎn)基金資助

參考文獻(xiàn)

1李君慶，張均田.細(xì)胞程序性死亡與疾病.中國(guó)藥學(xué)雜志,1996,31:198－200.

2GudasLJ.Retinoids,retinoid-responsivegenes,celldifferentiationandcancer.CellGrowthDiffer,1992,3:655－662.

3HaakeAR,PolakowskaRR.Celldeathbyapoptosisinepidermalbiology.JInvestDermatol,1993,101:107－112.

4傅乃武，金蘭萍，郭水泗，等.β－欖香烯的抗腫瘤作用和藥理學(xué)研究.中藥通報(bào),1984,9:35.

5時(shí)繼慧，李成章，劉德蘭，等.溫莪術(shù)揮發(fā)油的實(shí)驗(yàn)藥理研究：β-欖香烯的抗腫瘤作用的研究.中藥通報(bào),1981,6:36.

6谷玉琴，李秀君，陳玉仁，等.0.5％β欖香烯治療銀屑病53例.中華皮膚科雜志,1994,27:154.

(收稿：1998－01－05修回：1998－08－24)

（責(zé)任編輯：zxwq）