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銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點(diǎn)A677V關(guān)系的研究

中華皮膚科雜志1999年第2期第32卷論著

作者：楊維玲王曉慧鄭淑云孫智晶王柏秋傅松濱

單位：楊維玲王曉慧鄭淑云150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；孫智晶王柏秋傅松濱哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物遺傳學(xué)研究室

關(guān)鍵詞：銀屑??；四氫葉酸脫氫酶；聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)

【摘要】目的探討銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點(diǎn)A677V的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，檢測(cè)了3個(gè)銀屑病家系和39例銀屑病患者的亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點(diǎn)A677V。結(jié)果銀屑病患者亞甲基四氫葉酸還原酶不耐熱缺陷與正常人有顯著性差異。結(jié)論亞甲基四氫葉酸還原酶A677V突變型與銀屑病發(fā)病相關(guān)。

StudyontheRelationshipBetweenPsoriasisandthePolymorphic

SiteA677VofMethylenetetrahydrofolateReductaseGene

YANGWeiling,WANGXiaohui,ZHENGShuyun,etal.

DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetweenpolymorphicsiteA667Vof5,10-methylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)geneandpsoriasis.MethodsPCR-RFLPmethodwasusedtodetectthepolymorphismofMTHFRgenein3psoriasispedigreesand39psoriatics.ResultsGenotypefrequenciesofthepsoriasticswereA/A-20.51％,A/V=48.72％andV/V=30.76％;theallelicfrequencieswereA=0.4487andV=0.5513.ConclusionThereisasignificantdifferenceofMTHFRgenethermolabiledefectbetweenthepsoriaticsandthecontrol,andourresultsdemonstrateMTHFRgeneisrelatedtoA667Vmutant.

【Keywords】PsoriasisTetrahydrofolatedehydrogenasePCR-RFLP

人亞甲基四氫葉酸還原（methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)基因定位在1P36.3[1]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的MTHFR缺陷與其不耐熱變化這兩種變異是由基因不同突變引起的[2]，其中不耐熱MTHFR缺陷主要由MTHFR677密碼子中C被T置換引起，這種突變直接影響MTHFR的活性和耐熱性[3，4]。已有報(bào)道腦血管、周圍血管、冠狀血管疾病與MTHFR的不耐熱變化密切相關(guān)[5]。再者亦有報(bào)道，銀屑病患者高血壓和冠心病的相對(duì)危險(xiǎn)性分別是正常人群的15.4倍和11倍[6]?；谏鲜?，我們以PCR－RFLP方法檢測(cè)了銀屑病患者的MTHFR基因多態(tài)位點(diǎn)A677V，旨在探討MTHFR基因多態(tài)位點(diǎn)A677V與銀屑病發(fā)病的關(guān)系。

材料和方法

1.血樣來(lái)源和基因組DNA提取：銀屑病患者及其親屬共48例，其中男27例，女21例，靜脈采血5～6mL，枸緣酸鈉抗凝。應(yīng)用常規(guī)酚－氯仿抽提法，提取外周血基因組DNA。

2.MTHFR基因特定片段的擴(kuò)增及TapI酶切反應(yīng)：應(yīng)用提取的患者及正常對(duì)照組的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增基因組DNA中MTHFR基因。PCR反應(yīng)總體積為30μL，其中含模板200ng,TaqDNA聚合酶1.5U，4×dNTP50μmol/L,引物各0.2μmol/L,MgCl21.5mmol/L,Tris-HCl20mmol/L(pH8.3),KCl25mmol/L,0.05％吐溫20。應(yīng)用美國(guó)PE公司DNAThermalCycler進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；95℃30s,62℃30s，72℃1min；72℃延長(zhǎng)5min，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，取10μLPCR產(chǎn)物加入2UTaqI酶，10×緩沖液2μL,ddH2O7.8μL65℃酶切15h，引物P1（NCO－351）5'-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3';P2(NCO－352)5'-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3'。

3.酶切產(chǎn)物電泳及檢測(cè)：取10μL酶切產(chǎn)物與2μL6×加樣緩沖液[25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，40％（W/V）蔗糖水溶液]混合后上樣于12％（交聯(lián)比=29∶1）非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V恒壓電泳3～4h后揭膠，AgNO3染色后觀察結(jié)果。

結(jié)果

1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)包含MTHFR基因677密碼子的134bp片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.MTHFR677多態(tài)位點(diǎn)電泳圖譜：含MTHFR677多態(tài)位點(diǎn)的片段酶解后，可分出3種基因型，此位點(diǎn)原有C被T置換后，產(chǎn)生一個(gè)TaqI限制性酶切位點(diǎn)，野生型A677/A677序列中無(wú)TaqI限制性酶切位點(diǎn)，只見(jiàn)一條電泳帶，為134bp；雜合突變型A677/V677可見(jiàn)3條電泳帶，分別為134bp、75bp、59bp，純合突變型V677/V677可見(jiàn)2條電泳帶，分別為75bp、59bp。

表1銀屑病患者亞甲基四氫葉酸還原酶A677V基因型頻與等位基因頻率

組別例數(shù)基因型頻率等位基因頻率A/AA/VV/VAV患者一級(jí)親屬906333.33%66.67%銀屑病患者398191244.87%55.13%正常對(duì)照組7926431060.13%39.87%注：A：野生型，V：突變型銀屑病患者純合突變型（V/V）與正常對(duì)照組之間，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，有顯著性差異；其突變型基因頻率（V）與正常對(duì)照組之間，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，無(wú)顯著性差異?；颊咭患?jí)親屬純合突變型（V/V）與正常對(duì)照組之間，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＞0.05，無(wú)顯著性差異；其突變型基因頻率（V）與正常對(duì)照組之間，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，無(wú)顯著性差異。

討論

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，不完全角化和炎癥為特點(diǎn)的慢性皮膚病。目前認(rèn)為銀屑病是由多種因素（包括遺傳因素、環(huán)境因素、社會(huì)心理因素）共同作用引起的病理改變，其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本文從分子生物學(xué)角度，研究了銀屑病與MTHFR多態(tài)位點(diǎn)A677V的關(guān)系。結(jié)果表明，銀屑病患者存在MTHFR不耐熱缺陷，提示MTHFRA677V突變型與銀屑病發(fā)病有一定相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀屑病與MTHFR基因多態(tài)位點(diǎn)A677V的相關(guān)性進(jìn)行了初步研究，表明銀屑病與MTHFR基因多態(tài)位點(diǎn)A667V有一定的相關(guān)性。

黑龍江省科委自然基金資助課題

參考文獻(xiàn)

1GoyetteP,SumnerJS,MilosR,etal.Humanmethylenetetrahydrofolatereductase:isolationofacDNA,mappingandmutationidentification.NatureGenet,1994,7:195－200.

2KangSS,ZhouJ,WongPWK,etal.Intermediatehomocysteinemia:athermolabilevariantofmethylenetetrahydrofolatereductase.AmJHumGenet，1998,43:414－421.

3GoyetteP,FrostP,RosenblattDS,etal.Sevennovelmutationsinthemethylenetetrahydrofolatereductasegeneandgenotype/phenotypecorrelationsinseveremethylenetetrahydrofolatereductasedeficiency.AmJHumGenet，1995,56:1052－1059.

4KangSS,WongPW,SusmanoA,etal.Thermolabilemethylenetetrahydrofolatereductase:aninheritedriskfactorforcoronaryarterydisease.AmJHumGenet,1991,48:536－545.

5KangSS,PassenEL,RuggieN,etal.Thermolabiledefectofmethylenetetrahydrofolatereductaseincoronaryarterydisease.Circulation,1993,88:1463－1469.

6劉承煌主編.銀屑病的臨床和研究.上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1992.31－32.

(收稿：1998－01－19修回：1998－08－17)

（責(zé)任編輯：zxwq）

銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點(diǎn)A677V關(guān)系的研究

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