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銀屑病皮損中細胞凋亡的原位標記檢測與bcl-2的表達

中華皮膚科雜志1998年第2期第31卷論著

作者：倪曉孫建方楊海平曾學思桑紅桂李阿梅高新元葉干運

單位：210042南京，中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學皮膚病研究所

關鍵詞：銀屑??；細胞凋亡；bcl-2

【摘要】目的探討細胞凋亡與銀屑病發(fā)病的關系。方法用末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)介導的d-UTP-生物素缺口末端標記技術(TUNEL)，原位檢測了銀屑病皮損的凋亡角朊細胞，應用免疫過氧化酶技術研究了正常人皮膚與銀屑病皮損的p53蛋白、增殖細胞核抗原(PCNA)和bcl-2的表達。結果

銀屑病表皮各層中，大量角朊細胞呈現(xiàn)出細胞凋亡的形態(tài)學和生化特征?；讓蛹氨砥ぶ邢虏扛鲗哟罅拷请眉毎鸓CNA染色強陽性，基底層中bcl-2陽性細胞明顯減少。結論在銀屑病皮損中角朊細胞凋亡增加，推測可能是針對細胞過度增殖的一種穩(wěn)態(tài)機理。

DetectionofApoptosisbyinSituLabelingandStudyontheExpressionofbcl-2inLesionsofPatientswithPsoriasisNiXiao,SunJianfang,YangHaiping,etal.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinvolvementofapoptosisinthelesionsofpatientswithpsoriasis.MethodsTheapoptosiswasdetectedwithterminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabeling(TUNEL),andtheexpressionofp53,PCNAandapoptosis-suppressingproteinbcl-2wasassessedwithimmunoperoxidasetechniqueinpsoriaticlesionsandnormalskin.ResultsAlargenumberofkeratinocytesshowingbiochemicalandmorphologicfeaturesofcellsundergoingapoptosiswereobservedinallthesuprabasallayersofthepsoriaticepidermis.TheplaquesfromallpatientsanalysedshowedmarkedincreaseinthenumberofPCNApositivecellsinthemiddleandbasalkeratinocytes,andadramaticreductioninthenumberofbcl-2positivecellsinthebasalcelllayer.ConclusionTheincreasedapoptosisofkeratinocytesinthelesionsofpsoriasismightbeahomeostaticmechanismtothehyperplasiaofcells.

【Keywords】PsoriasisApoptosisbcl-2

為了探討銀屑病的發(fā)病與細胞凋亡的關系，我們采用末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)介導的d-UTP-生物素缺口末端標記(TUNEL)技術，分析了銀屑病角朊細胞的凋亡情況，并與常規(guī)HE染色進行了對比研究，同時檢測了銀屑病皮損中p53蛋白、增殖細胞核抗原(PCNA)及凋亡抑制蛋白bcl-2的表達。

資料和方法

(一)病例：共18例患者，其中14例尋常型患者，男8例，女6例，均為靜止期斑塊型，2個月內(nèi)未接受系統(tǒng)及局部治療；4例紅皮病型銀屑病，男女各2例?；颊吣挲g15～50歲(平均33.7歲)；病程1個月至30年(平均6.2年)；PASI評分5.8～60.0(平均30.4分)。對照標本10份，均為外科手術正常皮膚。

(二)實驗方法：皮損邊緣鉆孔取材，10%中性福爾

馬林液固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，2張行常規(guī)HE染色，2張行TUNEL法染色、2張供免疫組化研究。TUNEL法的主要步驟如下：切片常規(guī)脫蠟水化；20μg/ml蛋白酶K消化15分鐘；0.3%H２O２室溫處理20分鐘；標記緩沖液(含0.03U/μlTdT和0.04nmol/μl生物素-11-dUTP)濕盒中37℃孵育60分鐘；1∶50稀釋的親和素-辣根過氧化物酶(Avidin-HRP)37℃孵育30分鐘；新鮮配置的0.03%H２O２-0.05mg/mlDAB顯色液顯色10分鐘，蘇木素復染；封片鏡檢［1，2］。

免疫組化研究采用標準的ABC過氧化物技術，所用一抗包括p53(Do-7)、PCNA(PC10)和bcl-2(124)單克隆抗體，均為Dako公司產(chǎn)品，抗體稀釋度分別為1∶100、1∶100和1∶50，采用VectastainABC試驗盒進行檢測。除PCNA外，染色前標本均行微波抗原修復。

結果

(一)HE染色：HE染色切片中的凋亡細胞標準參照Kerr等［3］提出的3個條件：①核染色質沿核膜濃縮呈環(huán)狀或新月狀和(或)核片段化；②細胞皺縮；③胞漿嗜酸性變，具備以上二條者即認定為凋亡細胞。本次觀察發(fā)現(xiàn)，尋常型14例中有6例(6/14，占42.9%)、紅皮病型4例中4例HE染色切片中可見表皮基底層上各層散在分布凋亡細胞，以紅皮病型更典型和多見，正常人皮膚中未見或偶見陽性細胞。

(二)TUNEL法：細胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細胞。8例尋常型(占57.1%)和4例紅皮病型銀屑病的表皮基底上各層可見較多散在分布陽性細胞，棘層上層及顆粒層陽性細胞密集。紅皮病型切片中更典型和多見。正常人皮膚中未見或偶見陽性細胞。

(三)凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)的計算：每張陽性切片選取5個陽性細胞最多的高倍視野(×400)，計算500個角朊細胞中陽性細胞所占的百分比。結果發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病皮損TUNEL染色的AI［24(18～30)］高于HE染色［14(8～19)］，紅皮病型TUNEL染色的AI［49(37～61)］也高于HE染色［38(24～54)］，紅皮病型的AI明顯高于尋常型。

(四)免疫組化結果：將染色強度分為陰性(-)、弱(+)、中()和強()四級，將染色頻度按陽性細胞的百分比(計算方法同AI的計算)分為四級：陰性(＜1%)、低表達(1%～10%)、中表達(10%～50%)和高表達(≥50%)。結果：①bcl-2陽性反應定位于胞漿，正常皮膚表皮基底細胞呈中高表達、中強陽性反應，18例銀屑病皮膚中bcl-2的表達均明顯減少，僅基底層少數(shù)樹狀突細胞呈弱陽性反應；②p53陽性反應定位于細胞核，所有銀屑病標本中不見或偶見基底上層少數(shù)角朊細胞呈弱陽性反應；③PCNA陽性反應定位于細胞核，銀屑病表皮中PCNA均呈中高表達，平均表達率達52.3%，染色強度以中強為主，陽性細胞分布在基底層及棘層中下部。正常對照表皮呈PCNA低表達，平均表達率6.5%，染色強度以弱、中居多，偶見強陽性反應，陽性細胞集中在基底細胞層中。

討論

細胞凋亡開始時，細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶被激活，并在核小體間切割DNA鏈，使DNA降解為以核小體(180～200bp)為單位的片段，也產(chǎn)生了與DNA片段數(shù)目相同的3′羥基末端，TUNEL技術正是基于對細胞凋亡分子機理的充分認識，用TdT將生物素化的dUTP標記至3′羥基末端。該方法結合了組織化學的方法，定位準確，可發(fā)現(xiàn)早中期凋亡細胞。本實驗發(fā)現(xiàn)，鏡下有的細胞核質聚集于核膜下，提示早期的染色質濃縮；一些細胞核內(nèi)染色質均勻一致，表明DNA片段化分布于整個細胞核，凋亡已進一步發(fā)展。因此，與HE染色的形態(tài)學標準相比較，TUNEL法可發(fā)現(xiàn)更多的凋亡細胞，AI也相對增高，可更準確地反應凋亡發(fā)生的程度。

bcl-2是一種凋亡抑制基因，其編碼的蛋白能抑制細胞發(fā)生凋亡，延長細胞的存活時間。我們的實驗表明，在銀屑病皮損中，bcl-2在基底細胞中的表達較正常人明顯下降，這與Bianchi等的觀察一致［4］。這一結果提示，銀屑病角朊細胞凋亡的增加起源于基底細胞，推測由于基底細胞中bcl-2的表達下降，使原先處于G０期的基底細胞提前進入細胞增殖周期，這些細胞在樹狀突細胞和免疫細胞產(chǎn)生的各種因子作用下發(fā)生凋亡［4，5］。

我們還觀察到，同一皮損中既有PCNA陽性細胞的增加，又有大量凋亡細胞的存在；PCNA陽性細胞以表皮中下層多，凋亡細胞則分布于表皮中上層，進一步證明角朊細胞的過度增殖與凋亡增加同時伴隨著銀屑病的發(fā)病，因果關系還不十分清楚，推測凋亡增加是針對過度增殖而發(fā)生，是機體維持細胞動力學穩(wěn)態(tài)的一種保護機理。我們的實驗還表明，具凋亡促進作用的野生型p53在銀屑病皮損中的表達并無增加，提示野生型p53在銀屑病的發(fā)病中可能未起重要作用。我們的初步觀察還表明，紅皮病型銀屑病皮損中角朊細胞凋亡較尋常型中更常見，是否細胞凋亡在該型的發(fā)病中起著更為重要的作用，因觀察病例太少，還不足以下此結論，有待進一步研究。

參考文獻

1GoldR,SchmiedM,RotheG,etal.DetectionofDNAfragmentationinapoptosis:applicationofinsitunicktranslationtocellculturesystemsandtissuesections.JHistochemCytochem,1993,41∶1023-1030.

2GavrieliY,ShermanY,Ben-SassonSA,etal.IdentificationofprogrammedcelldeathinsituviaspecificlabelingofnuclearDNAfragmentation.JCellBiol,1992,119∶493-501.

3KerrJFR,WinterfordCM,HarmanBV.Apoptosis:itssignificanceincancerandcancertherapy.Cancer,1994,73∶2013-2026.

4BianchiL,FarraceMG,NiliG,etal.Abnormalbcl-2and“tissue”transglutaminaseexpressioninpsoriaticskin.JInvestDermatol,1994,103∶829-833.

5MountzJD,WuJ,ChenJ,etal.Autoimmunedisease-Aproblemofdetectiveapoptosis.ArthritisRheumat,1994,37∶1415-1420.

(收稿：1997-09-05修回：1997-12-23)

（責任編輯：zxwq）

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