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細胞毒T細胞識別皮膚T細胞淋巴瘤的T細胞受體個體基因型肽抗原

中華皮膚科雜志1999年第1期第32卷論著

作者：丁鐵鋼邱丙森LyndaTyrellJackLongley

單位：丁鐵鋼LyndaTyrellJackLongley(美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院皮膚科)；邱丙森(上海醫(yī)科大學(xué)皮膚病學(xué)研究所)

關(guān)鍵詞：淋巴瘤；T細胞；皮膚；受體；抗原；T細胞

【摘要】目的確定細胞毒T細胞是否能識別由第三互補決定區(qū)特異基因編碼的肽。方法選擇兩例皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)患者(SS和AR)的CD4＋、Vβ8＋惡性T細胞作為測定肽序列的細胞，CD8＋非惡性T細胞作為殺傷或反應(yīng)性細胞，和轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞樣細胞作為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原提呈的細胞。結(jié)果患者SS的惡性T細胞的T細胞受體(TCR)β鏈的個體基因型肽可刺激CD8＋T細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)-α，但患者AR的MTC的TCR蛋白的個體基因型區(qū)的對照肽則不刺激產(chǎn)生TNF-α。反之，患者AR的CD8＋T細胞藉分泌TNF-α而對自身肽應(yīng)答，但對來源于對照患者SS和人類免疫缺陷病毒感染患者的其他肽不應(yīng)答。結(jié)論細胞毒T細胞對CTCL的淋巴細胞個體惡性克隆獨特的特殊的MHCⅠ類相關(guān)肽的識別和應(yīng)答具有特異性，確定CTCL的腫瘤特異性定位，可進一步為能夠激發(fā)對腫瘤細胞的CD8＋T細胞參與的免疫應(yīng)答的疫苗研制和治療提供新線索。

RecognitionofCutaneousTCellLymphomaTCellReceptorIdiotypicPeptideAntigensbyCytotoxicTCells

DINGTiegang＊,QIUBingsen＊＊,LyndaTyrell,etal.＊DepartmentofDermatology,MedicalCollege,YaleUniversityUSA,＊＊DepartmentofDermatology,HuashanHospital,ShanghaiMedicalUniversity,Shanghai200040

【Abstract】ObjectiveTodeterminewhethercytotoxicTcellscouldrecognizethepeptidesencodedbyspecificgeneofthethirdcomplementarydeterminingregions(CDR3).MethodsThecellsseparatedfromtwopatientswithcutaneousTcelllymphoma(CTCL)(SSandAR)CD4＋.Vβ8＋malignantTcells(MTC)wereusedaspeptidesequencedeterminingcells,CD8＋non-malignantTcellsaskillercellsorreactivecells,andtransformedlymphoblastoidcellsasmajorhistocompatibilitycomplex(MHC)antigenpresentingcells.ResultsTheidiotypicpeptidefrompatientSS'sTCRβchainofMTCcouldstimulatetumornecrotizingfactor(TNF)-αproductionbyautologousCD8＋Tcells.TNF-αproductionwasnotstimulatedbyacontrolpeptidederivedfromtheidiotypicregionofpatientAR'sTCRproteinofMTC.Incontrast,theCD8＋TcellsofpatientARrespondedtoautologouspeptidebysecretingTNF-α,butdidnotrespondtootherpeptidesderivedfromthecontrolpatientSSandpatientswithHIVinfection.ConclusionCytotoxicTcellsmayrecognizeandrespondtoaspecificMHCclassIassociatedpeptideuniquetoindividualmalignantclonesoflymphocytesinCTCL.Theidentificationofatumor-specificepitopeinthisdiseasemaypermitthedevelopmentofvaccinesthatcouldboostorinitiatetheCD8＋Tcells-mediatedimmuneresponsetothetumorcells.

【Keywords】Lymphoma,T-cell,cutaneousReceptors,antigen,T-cell

皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)是一種CD4＋T細胞性惡性淋巴瘤。瘤細胞開始浸潤皮膚但往往累及血液、淋巴樣器官和內(nèi)臟。Heald等[1]發(fā)現(xiàn)一組晚期CTCL患者經(jīng)光細胞分離法(photopheresis)治療緩解后，血循環(huán)中CD8＋細胞的數(shù)目接近正常。CTCL的預(yù)后[2]通常與皮膚損害中主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子、活化的CD8＋細胞毒T細胞(CTC)相關(guān)。在體外，從CTCL患者分離出的CD8＋CTC可選擇性地溶解自身惡性T細胞(MTC)[3]。因CD8＋T細胞識別由MHCⅠ類分子提呈的肽抗原，我們探索能夠提供這種肽的腫瘤特異性蛋白。T細胞抗原受體(TCR)是由α和β鏈組成的一種異二聚體，因此，TCR鏈是腫瘤特異性肽的一種理想的可能來源。每個TCR鏈含有稱之為互補決定區(qū)(CDR)的變(V)區(qū)，因這些V區(qū)與MHC抗原復(fù)合體部分起互補和直接相互作用。每個鏈的高變區(qū)稱為CDR3或個體基因型(idiotypic,IT)區(qū)，直接與MHC分子結(jié)合的肽抗原相互作用，并決定TCR的抗原特異性。從理論上，來源于CDR3的肽可由T細胞的MHCⅠ類分子顯示并由其他T細胞識別。我們設(shè)想，按照IT序列編碼的肽抗原可作為細胞溶解性T淋巴細胞的靶對象，可研究CD8＋T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用和免疫應(yīng)答。

材料和方法

病例選擇和實驗方法：從經(jīng)光細胞分離法治療的44例CTCL患者中，審核血循環(huán)中MTC符合以下特征的患者：①能用單克隆抗體TCR-V持續(xù)分離出，②表達相同的MHCⅠ類抗原。因目前可靠的Vβ8特異性抗體和已知MHCⅠ類肽的數(shù)目有限，僅選擇2例(患者SS和AR)，其MTC正好表達TCRVβ8蛋白。

分離淋巴細胞：經(jīng)知情同意，從經(jīng)治療性光細胞分離法所取得的富有白細胞成分中獲取外周血中單一核細胞，以磁性免疫親和法純化淋巴細胞[3]。用小鼠抗Vβ8a(Tcellscience,cambridge,MA)和結(jié)合含鐵小滴的羊抗小鼠免疫球蛋白(DynallCorp,LakeSuccess,NY)挑選陽性MTC。用直接結(jié)合的抗CD8磁性小滴(DynallCorp)挑選CD8＋非惡性T細胞。在培養(yǎng)時，小滴經(jīng)磁性去除。挑選后，經(jīng)流式細胞測定平均純度，MTC為95％，CD8＋非惡性T細胞為84％。

CD8＋T細胞的制備：將CD8＋T細胞培養(yǎng)于含有IL-2(500U/mL,Genzyme)和IL-7(5ng/mL)之RPMI1640和10％人AB血清中，每周用經(jīng)γ照射的自身MTC(1500rads,cesiumirradiator)刺激1次。再經(jīng)以往所述的51Cr釋放的測定[3]，確定其細胞毒性。

提呈抗原細胞株的建立：用直接結(jié)合的抗CD3磁性小滴(DynallCorp)從淋巴細胞制備中去除T細胞。其余細胞(大多為B淋巴細胞)經(jīng)Epstein-Barr病毒孵化，使其轉(zhuǎn)化。將已轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞樣細胞(＞95％的CD19＋B細胞)保留于RPMI1640和5％小牛血清(Gibco)中，用以作為提呈MHC抗原的靶細胞。

MHC類型的確定和特異肽鏈的制備：應(yīng)用以往所述的cDNA序列化[4]，確定TCR序列?；颊咄庵苎馨图毎筛鐐惐葋喆髮W(xué)組織相容性定型實驗室(紐約)作HLA定型。將患者Ⅰ類分子中已知的肽結(jié)構(gòu)域單元(motif)，比較TCRCDR3蛋白序列，確定可能的靶肽[5，6]。肽由RauinSymphonyPeptideSynthesizer合成，高壓液態(tài)色譜儀純化，其純度由主體光譜測定(massspectrometry)證實。

肽識別檢驗：利用檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放，確定CTC是否能與TCR肽起反應(yīng)[7]。在RPMI/0.5％BSA中，將CD8＋細胞(效應(yīng)細胞)加入經(jīng)γ照射的自身B淋巴母細胞樣細胞(靶細胞)，效應(yīng)細胞與靶細胞的比例不一[最佳比例為（1.5～2）×105CD8＋細胞和2×104經(jīng)γ照射的淋巴母細胞樣細胞]。在23℃下將CD8＋細胞與來源于TCR或?qū)φ针恼袷?h。18h后用商業(yè)性比色ELISA法(R＆D系統(tǒng)，Minneapolis,MN)測試上清液。阻止試驗：用人類HLAA、B和C分子所共有的非多態(tài)性(non-poly-morphism)決定簇反應(yīng)的小鼠單克隆抗體W6/32先阻CTC接近MHCⅠ類分子的機會(以1∶10培養(yǎng)上清液稀釋，ATCC＃HB95)，在4℃下預(yù)先孵化靶細胞30min，或比較非相關(guān)特異性的對照抗體的象征性圖像(isotype)作阻止試驗。孵化前用肽將細胞洗去并作上述TNF-α測定。

結(jié)果

患者SS和AR的外周血中MTCTCRβIT肽的HLA表型分別示A29/32、B7/44、Cw4/7和A11/31、B52/57、Cw6/?(即未確定的第二等位基因)，Ⅰ類結(jié)構(gòu)域單元相同，分別為SAVYFCASSFVMRYT、Vβ8DJβ2.3和SAVYFCASSLIGGSYNE、Vβ8DJβ2.1，IT包括的肽序列均為9個氨基酸長，所不同的只是兩個氨基酸，具有預(yù)計與由Cw4MHC分子提呈和結(jié)合的結(jié)構(gòu)域單元。MHCCw4分子由患者SS而非AR表達和提呈。另外，CDR3(IT區(qū))含有預(yù)計與B52MHC分子結(jié)合的序列，B52分子由患者AR而非SS表達。

患者SS的TCRβ鏈的IT肽序列(S2，VYFCASSFV，含有等位基因特異性序列結(jié)構(gòu)域單元的肽(AGSSM)(HLA-Cw4、HLA-Cw7、HLA-B52)，經(jīng)自身CD8＋T細胞(S11)刺激，產(chǎn)生TNF-α，而對照肽則不受刺激，不產(chǎn)生TNF-α(圖1)。C1也符合Cw4結(jié)構(gòu)域單元，由相同2N和C末端氨基酸，Cw4錨殘基組成，但后者內(nèi)部5個氨基酸的序列(order)則不同，而CD8＋細胞不被患者AR之TCRβ鏈之IT肽刺激，雖然R2也與Cw4結(jié)合的結(jié)構(gòu)域單元相同。因此，說明CD8＋細胞在免疫應(yīng)答時，不僅要與MHCⅠ一致，而且須與特異性IT抗原一致。圖1CD8＋細胞毒T細胞（S11）在自身惡性T細胞的TCR個體基因

型區(qū)一致的合成肽應(yīng)答時，產(chǎn)生TNF-α而對照組則無相應(yīng)的反應(yīng)

阻止試驗結(jié)果如圖2，經(jīng)抗MHCⅠ類抗體W6/32預(yù)孵，減少了TNF-α對自身IT肽(S2)的應(yīng)答，而具有同樣象征性圖像但無相關(guān)特異性的腹水(ASC)則不示抑制性。經(jīng)或不經(jīng)0.01nmol/L肽孵化的CD8＋CTC(患者SS之S21)或患者AR之R8培養(yǎng)示隨自身IT肽的起伏而達至對照肽C1或C2所見之基底水平或CD8＋細胞(S21或R8)受無肽提呈抗原細胞刺激時所見的水平。圖2應(yīng)用抗MHCI類抗體（W6/32）阻止實驗的結(jié)果

討論

從晚期CTCL患者外周血中分離出的CD8＋CTC和自身MTC為研究抗腫瘤的選擇性免疫應(yīng)答提供了一個特殊的機會。如TNF-α的釋放所示，本研究發(fā)現(xiàn)CTCL患者的外周血中CD8＋CTC可選擇性地識別來源于MTC的肽?？赡茏钣幸饬x的是，這些CTC識別來源于MTC的TCRβ鏈的CDR3或IT肽，而這種TCR的這一部分與TCRα鏈的CDR3同為CTCL的克隆擴增MTC的所特有。因抗Ⅰ類骨架抗體可阻止對肽的識別，故這些CD8＋CTC可識別由MHCⅠ類分子提呈的肽。

具有相同MHC抗原的CTC對轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者腫瘤的消退起中介作用，并已證明在人和動物的模型中在體內(nèi)可導(dǎo)致腫瘤消退。這些CTC能夠識別來源于黑素瘤特異性蛋白的肽[8]。我們的發(fā)現(xiàn)，首次證明腫瘤特異性CTC能夠?qū)μ幱谙嗤琈HCⅠ類方式腫瘤相關(guān)特異性T細胞肽的應(yīng)答。現(xiàn)今的研究[3]也證實，CTCL患者具有這樣的CD8＋T細胞，在通過對獨特抗原即TCRβ鏈的IT的識別，對MTC作特異性免疫應(yīng)答中，能夠起中介作用。

已有的實驗和臨床資料，支持這樣的概念即針對TCR部分具有特異性應(yīng)答。如對髓鞘堿性蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)的活化T細胞可引起嚙齒動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種癱瘓病——實驗性自體免疫性腦脊髓炎[9]。不過，注射已受損或非活化的同樣T細胞，可刺激限于MHC的CD8＋CTC細胞的應(yīng)答。這種應(yīng)答可以減輕以后與同樣克隆的、能獨立生存的活化T細胞的刺激作用[9]。采用來源于致病性克隆的TCRβ鏈的肽進行接種，也能獲得保護作用。

除動物實驗外，臨床研究已證明某些多發(fā)性硬化病患者具有顯著致病性T細胞克隆，并顯示限于應(yīng)用某些Vβ鏈。采用來源于那些TCRβ鏈的非IT部分的肽接種于患者，似可導(dǎo)致臨床改善[10]。再者，從健康人供給的外周血中分離出的CD8＋T細胞克隆，特異性地能識別由自身CD4＋T細胞表達的TCRVβ鏈[11]。不過，尚未證明這些克隆對IT定位具有特異性，似不識別由標準Ⅰ類分子提呈的肽。因此，我們的結(jié)果可能顯示一種對來源于人類TCR的IT成分的應(yīng)答。從理論上，通過對TCRIT的識別，人類免疫系統(tǒng)不僅能調(diào)節(jié)MTC，而且也調(diào)節(jié)對特殊抗原應(yīng)答的T細胞。

本文所用縮稱：CTCL：皮膚T細胞淋巴瘤，MHC：主要組織相容性復(fù)合體，CTC：活化的CD8＋細胞毒T細胞，MTC：自身惡性T細胞，TCR：T細胞抗原受體，CDR：互補決定區(qū)，IT：個體基因型

參考文獻

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(收稿：1997－08－01修回：1998－05－08）

（責任編輯：zxwq）

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