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湛江地區(qū)淋球菌流行株質(zhì)粒譜型的研究

臨床皮膚科雜志2000年第3期第29卷臨床及實(shí)驗(yàn)研究

作者：李國(guó)明陳群王勝春

單位：廣東醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，湛江，524023

關(guān)鍵詞：奈瑟氏淋球菌；耐藥性；質(zhì)粒譜

摘要：為探討淋球菌耐藥譜與質(zhì)粒譜之間的相互關(guān)系，對(duì)1998年～1999年廣東省湛江地區(qū)分離鑒定出的98株淋球菌，以堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，并分析質(zhì)粒譜型的分布情況。結(jié)果顯示98株淋球菌流行株，檢出質(zhì)粒的有90株，占91.84％；質(zhì)粒譜型12種，以7.4kb＋4.2kb,39.5kb＋7.4kb＋4.2kb為主，占38.76％。從而揭示湛江地區(qū)淋球菌流行株質(zhì)粒的分布現(xiàn)狀，為該地區(qū)淋病的分子流行病學(xué)研究打下了基礎(chǔ)，但質(zhì)粒譜與耐藥性之間的關(guān)系尚有待進(jìn)一步探討。

StudyontheplasmidprofilesofepidemicNeisseriagonorrhoeaestrainsinZhanjiang

LiGuomingChenQunWangShengchun

(DepartmentofMicrobiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,524023)

AbstractInordertoprobetheplasmidprofiles(PP)andtheirdistributionsofN.gonorrhoeae,theplasmidsof98gonococcalstrainsobtainedfrom1998through1999inZhanjiang(Guangdong)wereextractedbyalkalinelysistechnique.Thenanalysisofthedistributionsofplasmidsprofileswasperformed.Theresultsshowedthat90strainsofN.gonorrhoeaeharbouredplasmids,thedetectedpercentageaccountingfor91.84％.Therewere12typesofPP.ThePPtypesof7.4kb＋4.2kband39.5kb＋7.4kb＋4.2kbwereprominent(38.76％).ThestudyindicatedtheplasmiddistributionofN.gonorrhoeaeinZhanjiangandmadeabasisforthemolecularepidemiologicalstudyofgonorrheainthisarea.TherelationshipbetweenPPandtheresistancetoantimicrobialshastobeinvestigatedinfuture.

KeywordsNeisseriagonorrhoeaeDrugresistancePlasmidprofile

淋病目前是我國(guó)性傳播性疾病(STD)中發(fā)病率最高的病種。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌染色體突變及耐藥基因的轉(zhuǎn)移等原因，淋球菌對(duì)抗生素的耐藥日漸增多。單用抗菌藥物耐藥譜來(lái)分析耐藥菌株的流行趨勢(shì)意義不大，它不能區(qū)分某一地區(qū)的耐藥菌株是新近傳入株或是原有耐藥株的變異。質(zhì)粒譜分析是近幾年用作質(zhì)粒分析的分子生物學(xué)技術(shù)，包括瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)菌的質(zhì)粒特征和采用限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒作同源性分析。耐藥譜結(jié)合質(zhì)粒譜分析有助于鑒定不同地區(qū)來(lái)源的分離株，以及對(duì)淋病患者進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)和傳染源的追蹤[1]。我們對(duì)湛江地區(qū)1998年～1999年分離鑒定出的98株淋球菌進(jìn)行了質(zhì)粒譜的分析研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1菌株來(lái)源：從1998年～1999年本院附屬醫(yī)院、湛江市第二人民醫(yī)院、湛江農(nóng)墾中心醫(yī)院皮膚性病門診病人中分離鑒定出98株淋球菌。WHO標(biāo)準(zhǔn)菌株由美國(guó)疾病控制中心(CDC)的Campbell博士惠贈(zèng)。

1.2培養(yǎng)基：英國(guó)Oxiod公司生產(chǎn)的GC瓊脂。

1.3質(zhì)粒抽提：質(zhì)粒抽提方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[2]，并加以改良，具體操作簡(jiǎn)略為：將24h純培養(yǎng)的細(xì)菌用生理鹽水刮洗入Eppendof管，離心后的沉淀重懸于100μL預(yù)冷的溶液I(25mmol/LTris.HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0，溶菌酶10mg/mL)，劇烈振蕩，冰浴10min；加200μL新鮮配制的預(yù)冷的溶液Ⅱ(3％SDS，0.2mol/LNaOH)，迅速顛倒混勻2～3次，冰浴5min；再加入150μL溶液Ⅲ(5mol/LKAc,3mol/LHAc)顛倒振蕩10s，冰浴1h，8000r/min離心10min，收集上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇抽提1次，取上清，加2.5倍體積的冰乙醇，置－20℃2h,12000r/min離心10min，真空干燥沉淀物，加TE40μL，即為粗提質(zhì)粒DNA。

1.4瓊脂糖凝膠電泳及質(zhì)粒分子量大小計(jì)算：用TBE緩沖液配制0.8％瓊脂糖，按凝膠5v/cm的電壓，電泳3～4h，以λDNA/HindⅢ作為Marker，量取質(zhì)粒條帶在膠上的泳動(dòng)距離，并拍照。質(zhì)粒分子量大小的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Marker的電泳結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，以其相對(duì)遷移率為自變量，分子量對(duì)數(shù)值為因變量建立回歸方程，然后以待測(cè)質(zhì)粒條帶的遷移來(lái)計(jì)算其分子量大小。

2結(jié)果

湛江地區(qū)98株淋球菌流行株的質(zhì)粒檢出情況見表1。

表1湛江地區(qū)98株淋球菌質(zhì)粒檢出情況

質(zhì)粒大小(kb)檢出菌株數(shù)檢出率(％)42.51111.2239.54141.827.45859.164.26667.321998年～1999年湛江地區(qū)98株淋球菌質(zhì)粒譜分布情況見表2。

表21998年～1999年湛江地區(qū)98株淋球菌質(zhì)粒譜型分布情況

質(zhì)粒譜型(kb)菌株數(shù)構(gòu)成比(％)－88.1639.544.087.41010.204.277.1442.522.0442.5＋4.244.0842.5＋7.433.0642.5＋7.4＋4.222.0439.5＋4.21515.3039.5＋7.455.1039.5＋7.4＋4.21717.347.4＋4.22121.42合計(jì)98100.00從表1可看出，4.2kb(隱蔽性質(zhì)粒)和7.4kb質(zhì)粒檢出較高，檢出率分別為67.32％和59.16％；從表2中可看出，98株淋球菌未檢出質(zhì)粒的有8株，占8.16％，質(zhì)?？倷z出率為91.84％(90/98)。質(zhì)粒譜型有12種，以7.4kb＋4.2kb，39.5kb＋7.4kb＋4.2kb，39.5kb＋4.2kb為主，分別占21.42％，17.34％和15.30％。

3討論

對(duì)淋球菌質(zhì)粒的研究始于20世紀(jì)70年代。1973年美國(guó)的Englkirk首次從1例淋病患者中檢測(cè)到4.2kb隱蔽性質(zhì)粒，以后陸續(xù)檢測(cè)到耐青霉素質(zhì)粒(非洲型5.3kb、亞洲型7.4kb和4.9kb(多倫多型)、高度耐四環(huán)素質(zhì)粒(42.5kb)和接合型質(zhì)粒(39.5kb)[3]。

淋球菌攜帶質(zhì)粒存在明顯的地區(qū)差異性。楊曉燕[4]等人(1995年)對(duì)重慶地區(qū)100株淋球菌所攜帶的質(zhì)粒進(jìn)行了分析研究，質(zhì)?？倷z出率為92.0％，李桂娥[5]等(1996年)對(duì)新疆192株淋球菌進(jìn)行了質(zhì)粒分析研究，質(zhì)?？倷z出率為91.66％。我們對(duì)湛江地區(qū)(1998年～1999年)的98株淋球菌進(jìn)行了質(zhì)粒檢測(cè)，總檢出率為91.84％。雖然3個(gè)地區(qū)質(zhì)?？倷z出率基本一致，但各種質(zhì)粒的分布卻相差甚遠(yuǎn)。如重慶地區(qū)，檢出42.5kb質(zhì)粒18％，39.5kb質(zhì)粒52％，4.2kb質(zhì)粒86％，耐藥質(zhì)粒以“亞洲型”為主(分子量為5.6kb)，檢出率為36％；新疆地區(qū)，檢出39.5kb質(zhì)粒33.33％，4.2kb質(zhì)粒91.66％，耐藥質(zhì)粒中，“亞洲型”(7.4kb)占19.79％，“非洲型”(5.3kb)占7.29％；湛江地區(qū)，42.5kb質(zhì)粒檢出率為11.22％，39.5kb質(zhì)粒占41.82％，4.2kb質(zhì)粒檢出67.32％，耐藥質(zhì)粒(7.4kb)檢出59.16％。這些耐藥質(zhì)粒與淋球菌耐藥性的關(guān)系尚不清楚。

42.5kb質(zhì)粒攜帶TetM基因，介導(dǎo)高水平耐四環(huán)素，過(guò)去認(rèn)為此質(zhì)粒是由39.5kb質(zhì)粒獲得TetM基因而形成，但Gascoyne等報(bào)道，這兩種質(zhì)粒的限制酶圖譜明顯不同，目前認(rèn)為39.5kb質(zhì)粒和42.5kb質(zhì)粒并無(wú)同源性。39.5kb質(zhì)粒與7.4kb耐青霉素質(zhì)粒密切相關(guān)。Lind報(bào)道，81％帶7.4kb質(zhì)粒的耐青霉素淋球菌(PPNG)同時(shí)具有39.5kb質(zhì)粒[6]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，58株帶7.4kb的淋球菌同時(shí)具有39.5kb質(zhì)粒的有22株，表明39.5kb質(zhì)?？赡芎?.4kb質(zhì)粒傳遞有關(guān)。4.2kb隱蔽性質(zhì)粒可在大多數(shù)菌株中檢測(cè)到，我們本次檢出率為67.32％(66/98)，其意義不清。Korch等的實(shí)驗(yàn)證明，淋球菌的隱蔽性質(zhì)粒能整合于細(xì)菌染色體上(包括無(wú)質(zhì)粒菌株)，重組菌可發(fā)生菌毛、外膜蛋白等抗原性的改變[7]。

我們將湛江地區(qū)的98株淋球菌進(jìn)行了質(zhì)粒譜的分型，共分12型，，其中以7.4kb＋4.2kb和39.5kb＋7.4kb＋4.2kb這兩種為主，分別占21.42％和17.34％，進(jìn)一步了解質(zhì)粒譜型與耐藥性的關(guān)系，尚需由質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、接合及質(zhì)粒的消除試驗(yàn)加以證實(shí)(對(duì)此，作者另文報(bào)道)。淋球菌質(zhì)粒譜作為淋病流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的工具，其敏感性還不夠，質(zhì)粒譜除了與耐藥譜聯(lián)用外，尚需與其它分型方法結(jié)合使用，如血清學(xué)分型、營(yíng)養(yǎng)分型，這樣可以提高監(jiān)測(cè)的敏感性，從而提供更多的流行病學(xué)信息。

本課題得到廣東省衛(wèi)生廳"五個(gè)一工程"基金資助(.9601)

參考文獻(xiàn)

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4，楊曉燕，朱道銀.淋球菌質(zhì)粒及其與耐藥性的關(guān)系的研究.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，1997，11(3)：135～137

5，李桂娥，董雅榮，馬吉，等.產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶淋球菌與青霉素編碼質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性.中國(guó)皮膚性學(xué)病學(xué)雜志，1997，11(4)：202～203

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(收稿1999-10-06修回1999-12-21)

（責(zé)任編輯：zxwq）

湛江地區(qū)淋球菌流行株質(zhì)粒譜型的研究

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